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1.
试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性，为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象，运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因，构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48，纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明，试验成功构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，重组蛋白P48大小约为66 ku，纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应，血清抗体滴度达到较高水平（D450 nm值为1.126）。Western blotting结果显示，抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应，表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性，可作为牛支原体新型疫苗的候选基因，且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高，亲缘关系较近。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2019,(12)
本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP402R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP402R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP402R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512 000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。 相似文献
3.
运用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白(CPEP)基因,克隆至pMD-19T载体。经鉴定测序验证后,将获得的CPEP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建原核表达质粒pET-32a-CPEP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE以及Western blot分析免疫原性,纯化CPEP,并用纯化的蛋白免疫小鼠,检测其特异性血清IgG抗体水平及攻毒保护率。结果显示,成功构建原核表达质粒pET-32aCPEP;SDS-PAGE分析结果显示,得到约35ku的蛋白;Western blot分析显示,CPEP能与Hps SC-1阳性血清发生抗原抗体的特异性反应,证实该重组CPEP蛋白具有反应原性。以致死剂量的强毒株SC-1攻毒CPEP免疫小鼠,重组蛋白的免疫能够减缓发病,并表现出40%的保护率。重组蛋白CPEP的部分保护作用表明其可以作为免疫候选因子,为未来副猪嗜血杆菌标准化疫苗的研制奠定基础。 相似文献
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《经济动物学报》2021,25(3):132-139
为建立牛呼吸系统疾病主要病原-牛支原体的快速富集方法,试验采用PCR方法对牛支原体P48基因扩增,构建重组质粒pET32a(+)-P48。将重组质粒进行原核表达并进行纯化。将纯化的牛支原体P48蛋白作为免疫原与弗氏佐剂混合乳化免疫家兔,获得抗牛支原体P48蛋白的高免血清,同时对高免血清进行纯化。将纯化后多克隆抗体与NHS磁性微球进行耦联,制备免疫磁珠。对耦联缓冲液、抗体浓度进行优化。从富集牛支原体的时间、敏感性和特异性三方面对免疫磁珠进行评价。结果表明:成功地扩增出大小约1 407 bp的P48基因并表达出大小约62 ku的可溶性重组蛋白。制备的多克隆抗体的效价高达1∶64 000,且具有很高的特异性;抗体与磁珠耦联的最佳介质为2-吗啉乙磺酸;抗体质量浓度为200μg/mL与磁珠的耦联率最高;免疫磁珠在15 min之内就能够富集到牛支原体,且富集到浓度为1×10-3ccu/mL,具有良好的特异性。说明免疫磁珠技术能够快速富集牛支原体,为分离鉴定牛支原体提供一种新的可行性的方法。 相似文献
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《中国兽医学报》2015,(9):1463-1467
研究猪肺炎支原体168(Mycoplasma hyopneumoniae 168,Mhp168)弱毒株融合蛋白P65-DnaKc免疫原性。根据GenBank中Mhp168弱毒株p65和dnaKc基因的开放阅读框设计特异性引物,进行PCR扩增,构建原核表达载体pET-28α-P65,pET-28α-DnaKc以及pET-28α-P65-DnaKc,经原核表达并纯化获得的蛋白与佐剂以体积比1∶1乳化后免疫小鼠,通过酶联免疫吸附反应(ELISA)测定小鼠血清的抗体效价。选取抗体效价较高的小鼠进行攻毒试验,记录分析试验结果。经间接ELISA试验证明单蛋白P65、DnaKc以及融合蛋白P65-DnaKc均具有良好的免疫原性,血清效价分别为:1∶12 800、1∶51 200和1∶204 800,融合蛋白的血清抗体效价明显高于单蛋白;攻毒试验证明,P65-DnaKc重组蛋白疫苗的保护率可达90%。融合蛋白P65-DnaKc具有良好的优于P65和DnaKc单蛋白的免疫原性。 相似文献
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【目的】建立牛支原体抗体间接ELISA检测方法,为牛支原体灭活疫苗的效力检测提供方法。【方法】构建pET-32a-P48原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plyss感受态细胞筛选阳性质粒并进行双酶切验证,用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达,使用镍柱进行蛋白纯化,经SDS-PAGE验证蛋白纯度及分子质量大小,采用Western blotting检测重组P48蛋白特异性和反应原性;将重组P48蛋白免疫家兔制备多克隆抗体。建立牛支原体间接ELISA抗体检测方法并进行条件优化,确定阴阳性临界值。对建立的方法进行敏感性、稳定性、特异性及与平板凝集试验的符合率试验检测。【结果】经SDS-PAGE验证,P48蛋白分子质量大小为62.68 ku,纯度在90%以上;Western blotting检测结果显示,P48蛋白仅与相应抗体结合呈现单一条带,该蛋白特异性和反应原性良好;琼脂扩散方法测得阳性血清效价为1∶64。建立的间接ELISA检测方法条件优化结果为：抗原包被浓度为0.3μg/mL,1%BSA 37℃封闭120 min,待检血清按1∶1 280稀释,37℃孵育60 m... 相似文献
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传染性法氏囊病病毒HB株VP2蛋白的表达及免疫原性测定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB株)VP2蛋白的免疫原性,对VP2基因进行了表达及免疫原性测定。将传染性法氏囊病病毒HB株VP2基因亚克隆到原核表达载体pET-32a-c(+)中并对其进行了诱导表达。SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白约55ku,以包涵体形式存在。重组蛋白纯化后,免疫接种6周龄Balb/c小鼠,制备的血清ELISA效价在1∶6 400以上,说明所表达的HB株VP2蛋白免疫原性良好。 相似文献
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依据NCBI中安氏隐孢子虫囊壁蛋白(COWP)编码基因设计特异性引物,提取安氏隐孢子虫长春株总RNA,RT-PCR扩增目的基因AF,构建重组原核表达载体pET28a-AF,通过大肠杆菌BL21诱导表达,产物经SDS-PAGE以及Western blotting鉴定。然后纯化重组蛋白,通过免疫BALB/c小鼠进行体液免疫和细胞免疫水平的检测。结果显示,重组原核表达质粒pET28a-AF构建成功,Western blotting显示重组蛋白约为18 000,可被安氏隐孢子虫免疫小鼠的多克隆抗体和HRP标记的抗组氨酸抗体识别。重组蛋白免疫BALB/c小鼠的抗体水平差异显著(P0.05),与对照组相比,CD4+的值差异极显著(P0.01),而CD8+的值差异显著(P0.05)。结果表明,成功克隆并表达了重组安氏隐孢子虫囊壁蛋白,纯化的重组蛋白具有一定的免疫原性。 相似文献
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根据GenBank中登录的副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5(outer membrane protein P5,OMP5)基因序列设计1对特异性引物,以江西分离株NC0807基因组DNA为模板,扩增出OMP5基因。将其克隆到pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-OMP5,质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),通过SDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况和反应原性。重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫豚鼠,测定其免疫原性和保护效率。结果表明,重组蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达。表达的蛋白分子质量约为43 ku,能被副猪嗜血杆菌阳性血清识别。动物试验结果表明,重组蛋白免疫后能诱导产生高水平的OMP5特异性抗体,并可显著保护豚鼠抵抗副猪嗜血杆菌强毒菌株的攻击,提示OMP5是副猪嗜血杆菌的保护性抗原。 相似文献
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试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列(GenBank登录号:XM_003124236.4)设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a(+)连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。 相似文献
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试验旨在研究弓形虫胚层发育相关蛋白（TgERP）的免疫原性,以弓形虫RH株的基因组DNA为模板,扩增TgERP基因,将其连接于表达载体pET-30a(+)后,转化至Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞进行IPTG诱导表达,应用Western blotting对重组蛋白的反应原性进行分析,并用纯化后的TgERP蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,在37 ℃条件下用1.0 mmol/L IPTG诱导6 h表达可溶性TgERP蛋白的量最大。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白分子质量为16.7 ku,以可溶形式表达,纯化后蛋白条带单一。经Western blotting分析,TgERP蛋白有较好的反应原性;制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶51200,表明该蛋白具有较好免疫原性。提示,TgERP蛋白可作为血清学诊断方法的候选抗原和弓形虫病疫苗的候选分子,为建立弓形虫新型诊断方法和研制新型弓形虫疫苗奠定了基础。 相似文献
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试验为了研究牛冠状病毒NS32蛋白的免疫原性,以NS32作为研究对象,通过原核表达分析其抗原性。首先,从牛冠状病毒基因组中克隆出NS32编码基因,进一步将其克隆到原核表达载体上;其次,通过纯化重组的His-NS32蛋白进一步免疫小鼠,测定其特异性抗体水平评估NS32蛋白免疫原性。本试验成功地利用反转录PCR克隆出NS32基因,其片段大小为837 bp,序列同源性分析结果显示,该基因在不同牛冠状病毒分离株间高度保守。通过原核表达系统纯化蛋白并成功获得目的蛋白HiS-NS32,SDS-PAGE显示其大小约为32 ku。将纯化的蛋白免疫小鼠,免疫小鼠能够产生针对NS32蛋白的高水平特异性抗体,证明牛冠状病毒非结构蛋白NS32同样具有较高的免疫原性。本试验通过表达NS32蛋白证实了其免疫原性,为后期的NS32蛋白研究奠定了基础。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2020,(6)
本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段(S2A),将其克隆后插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1∶32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。 相似文献
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【目的】本研究选择原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus, DTMUV)核衣壳蛋白(Capsid protein),并制备其多克隆抗体,为DTMUV分子机制研究奠定基础。【方法】根据DTMUV-201909株基因序列,运用一步克隆技术将Capsid基因克隆至表达载体pET-30a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;使用ISA206佐剂与纯化后的重组蛋白混合乳化后免疫BALB/c小鼠,以获得多克隆抗体。间接ELISA方法测定获得的多克隆抗体效价,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)验证。【结果】试验成功构建pET-30a-Capsid重组质粒,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白大小约为18 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应,具有良好反应原性。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗Capisd蛋白多克隆抗体效价可达1... 相似文献
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为了比较鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus, DTMUV)E蛋白结构域Ⅰ-Ⅱ(EDⅠ-Ⅱ)与结构域Ⅲ(EDⅢ)的反应原性和免疫原性,试验将重组质粒pET-EDⅠ-Ⅱ[EDⅠ-Ⅱ基因插入表达载体pET-30a(+)构建的重组质粒]和pET-EDⅢ[EDⅢ基因插入表达载体pET-30a(+)构建的重组质粒]分别转化至大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,采用亲和层析法纯化重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ,通过Dot-blot试验和间接ELISA试验比较二者的反应原性;将重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ免疫小鼠,通过测定免疫小鼠血清中特异性抗体、病毒中和(VN)抗体和细胞因子(IL-6、IFN-γ)水平比较两者的免疫原性;将DTMUV分离株感染重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ免疫小鼠,采用实时荧光定量PCR方法检测小鼠肺脏、肝脏和脑组织中DTMUV RNA相对表达水平,比较重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ对免疫小鼠的保护力。结果表明：含重组质粒pET-EDⅠ-Ⅱ和pET-EDⅢ诱导4 h的菌体蛋... 相似文献
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《中国畜牧兽医》2015,(11)
为了揭示坏死梭杆菌(F.necrophorum)120ku血凝素相关外膜蛋白的免疫原性,根据F.necrophorum120ku血凝素相关外膜蛋白基因的抗原表位分布情况设计特异性引物,扩增出3个彼此重叠、覆盖整个开放阅读框的基因片段p1、p2、p3,分别构建重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3,在大肠杆菌中进行诱导表达,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting分析重组蛋白的表达情况和反应原性;以纯化的重组蛋白为抗原免疫试验兔,分析重组蛋白的免疫原性。结果显示,重组蛋白P1、P2、P3在大肠杆菌中均得到表达,分子质量分别约为48、59、62ku,能与F.necrophorum阳性的小鼠血清反应,可以刺激试验兔产生特异性抗体,说明F.necrophorum120ku血凝素相关外膜蛋白具有良好的免疫原性,为F.necrophorum基因工程亚单位疫苗的研制提供参考依据。 相似文献
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研究猪肺炎支原体168(Mycoplasma hyopneumoniae 168,Mhp168)弱毒株重组蛋白p65的免疫原性。根据GenBank中Mhp168弱毒株P65基因的开放阅读框设计特异性引物,进行PCR扩增,构建原核表达载体pET-28a-P65,经原核表达并纯化获得的重组蛋白与佐剂以体积比1∶1乳化后免疫注射小鼠,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定小鼠血清的抗体效价;选取抗体效价较高的小鼠进行攻毒试验。经间接ELISA证明,重组蛋白p65具有良好的免疫原性,血清效价为1∶12 800。攻毒试验证明,p65重组蛋白疫苗的保护率可达80%,证明重组蛋白p65具有良好的免疫原性。 相似文献
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为研究简单异尖线虫肌钙蛋白类过敏原的免疫特性,本研究提取了线虫总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增肌钙蛋白类过敏原(Anis1)基因,克隆入pMD18-T载体,测序正确后将anis1基因亚克隆入带有组氨酸标签的表达载体pET-30a,转入大肠杆菌BL21中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,表达目的蛋白。通过Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,融合蛋白采用Western blotting分析。将纯化的Anis1重组蛋白免疫小鼠,分离血清,ELISA检测不同时期血清抗体效价。酶切和DNA测序结果显示重组质粒构建成功,并诱导出重组Anis1蛋白,重组蛋白经Western blotting分析证实为目的蛋白,纯化蛋白Anis1免疫小鼠后,与对照组相比,能产生较高的抗体水平。Western blotting分析显示,重组蛋白Anis1能被免疫血清识别,说明简单异尖线虫重组蛋白Anis1具有较好的免疫原性和免疫反应性。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(7):1261-1267
原核表达并纯化马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此为抗原免疫家兔制备抗MARV-GP-RBD多克隆抗体。参照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位区域,设计特异性引物,采用PCR方法扩增RBD基因,扩增产物经双酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a(+)-GP-RBD,转化BL21(DE3)感受态表达宿主菌,在不同条件下(时间、IPTG浓度、温度)诱导表达目的蛋白,并用His-Band N+柱进行亲和层析纯化;以纯化的重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过SDS-PAGE、Western blot和IFA鉴定重组蛋白的反应原性及免疫原性。结果显示:PCR扩增到长度为453bp的RBD基因片段;构建的重组质粒pET-30a(+)-GP-RBD经双酶切后得到与目的片段长度相同的特异性条带,测序结果显示没有突变;转化产物在培养7h、终浓度为0.4mmol/L IPTG和37℃条件下能够充分诱导目的蛋白表达,得到相对分子质量为25 000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,BCA试剂盒产量测定,每升诱导的重组菌可纯化约20mg纯度较高的目的蛋白;Western blot检测证实重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白能同时被抗His标签的单抗和兔源多抗识别并发生特异性反应,证明重组蛋白有良好的反应原性;IFA鉴定证实所制备的兔源多抗能够特异性识别表达MARV GP蛋白的重组杆状病毒rBacmid-GP-VP40,证明重组蛋白具有良好的免疫原性。结果表明:成功表达、纯化了MARV GP RBD蛋白,并完成了兔源多抗的制备,为MARV亚单位疫苗的制备和抗原、抗体检测方法的建立奠定基础。 相似文献