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1.
试验旨在构建EfaA基因的原核表达质粒,并对其进行表达。根据GenBank中粪肠球菌EfaA基因序列（登录号：U03756）设计合成1对引物,利用PCR法扩增、克隆EfaA基因,并进行生物信息学分析,将EfaA基因亚克隆于pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。结果发现,试验成功获得大小为873 bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得分子质量约为59 ku的EfaA重组蛋白,以37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最大。经Western blotting分析发现,具有较好的反应原性。本试验成功构建原核表达质粒pGEX-4T-EfaA,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中成功表达。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2015,(17)
为了对羊流产嗜性衣原体MOMP基因片段进行原核表达,试验采用PCR方法扩增出去信号肽序列的MOMP基因片段,将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,转化E.coli感受态细胞BL21(DE3),用IPTG诱导表达该基因片段,并对重组质粒表达产物进行Western-blot检测。结果表明:重组质粒pGEX-4T-MOMP构建成功,并成功表达出蛋白质相对分子质量约为66 ku的重组质粒表达产物,该重组质粒表达产物主要以包涵体形式存在;经Western-blot检测,该重组质粒表达产物可与羊流产嗜性衣原体阳性血清反应。说明试验成功表达了羊流产嗜性衣原体MOMP基因片段。 相似文献
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利用大肠杆菌BL21表达禽流感病毒蛋白AM2,分离纯化目的蛋白,进行小鼠免疫制备多克隆抗体。将A型禽流感病毒M2基因的原核表达重组质粒pGEX-6p-1-AM2转化大肠杆菌感受态细胞BL21,经IPTG诱导后,在大肠杆菌表达系统中获得表达,并分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到了pGEX-6p-1-AM2的多克隆抗体。经western-blot免疫印迹分析,自制的多克隆抗体能特异地与AM2蛋白相互作用,这说明试验制备了特异性良好的抗AM2的多克隆抗体。 相似文献
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猪A组轮状病毒VP4全基因在大肠杆菌中的表达与检测 总被引：1，自引：1，他引：0
以猪轮状病毒mRNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了2331bp的VP4全基因,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆质粒pGEM-T-VP4.以BamHⅠ和SalⅠ双酶切pGEM-T-VP4和pGEX-6P-1,并将纯化的VP4基因亚克隆至融合型表达载体pGEX-6P-1中,构建出原核表达质粒pGEX-6P-VP4.将pGEX-6P-VP4转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约111.47 ku融合蛋白带.Western blot分析发现,该蛋白具有轮状病毒抗原性,从而为进一步研究轮状病毒的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础. 相似文献
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《中国动物传染病学报》2016,(3)
采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。 相似文献
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中国2个地方品系猪SLA-3原核表达载体构建及表达 总被引：2，自引：1，他引：1
为构建中国地方品系荷包猪及莱芜黑猪SLA-3(命名为SLA-3-HB和SLA-3-LW)原核表达载体及表达目的蛋白,试验通过PCR扩增获得SLA-3胞外区基因,并克隆至pMD19-T Simple载体,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,酶切及测序筛选阳性重组质粒;重组质粒经酶切回收,目的片段进一步连接pET-21a(+)表达载体,并转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导目的基因的表达;SDS-PAGE检测目的蛋白。结果显示,PCR成功扩增SLA-3-HB及SLA-3-LW胞外区,大小约850 bp,目的基因成功克隆至pMD19-T Simple载体,并筛选序列正确的阳性重组质粒。进一步研究证实,SLA-3-HB及SLA-3-LW成功连接到表达载体pET-21a(+),插入片段长度均为831 bp。经诱导后,SLA-3-HB及SLA-3-LW均成功表达,表达蛋白大小为31 ku,相对表达含量达到40%。本研究成功构建了中国地方品系荷包猪及莱芜黑猪SLA-3原核表达载体,为进一步研究其结构和功能奠定基础。 相似文献
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为检测熊源粪肠球菌心内膜炎抗原（EfaA）基因,用于快速检测东北黑熊粪肠球菌感染病例,本试验根据GenBank登录的粪肠球菌EfaA基因序列（登录号：U03756.1）合成了1对PCR引物,通过PCR法扩增合成长度为689 bp的目的片段。将PCR产物克隆于pMD19-T载体,之后将其转入大肠杆菌DH5α感受态细胞筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-EfaA并进行PCR、酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果显示,本试验成功克隆出熊源粪肠球菌EfaA基因,与GenBank登录的ATCC 29212菌株同源性为100.0%。本试验成功构建了重组克隆载体pMD19-T-EfaA,并对测序结果进行了蛋白质结构的预测,为进一步建立黑熊粪肠球菌病的诊断方法提供了理论依据,同时也为黑熊疾病的防制奠定了基础。 相似文献
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《中国家禽》2020,(6)
为制备鼠伤寒沙门菌SseB和SseL蛋白的特异性多克隆抗体(多抗),以鼠伤寒沙门菌S025为供体菌,PCR扩增sseB和sseL基因,插入原核表达载体pGEX-6P-1,转化BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,获得纯化蛋白免疫小鼠制备多抗;使用λ-red同源重组方法构建sseB和sseL基因缺失株;通过野生株和缺失株的Western-blot分析验证制备血清的特异性。结果显示:成功构建出重组质粒pGEX-6P-1-sseB和pGEX-6P-1-sseL,转化感受态细胞后,在IPTG 1 mmol/L、温度28℃、转速为220 r/min、诱导时间12 h的条件下,SseB和SseL蛋白呈可溶性表达;纯化蛋白免疫小鼠制备了多抗,Western-blot分析显示该多抗可特异性检测鼠伤寒沙门菌中的SseB和SseL蛋白。这两种蛋白多抗的获得为进一步研究其功能奠定基础。 相似文献
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利用DNAStar Protean模块预测分析水貂阿留申病毒（aleutian disease virus,ADV）NS1基因后,设计3对特异性引物,以吉林农业大学经济动物实验室保存的NS1全长克隆质粒NS1-pMD18-T为模板扩增NS1基因的3个截短片段,分别命名为L1N1、L2N2、L3N3基因,构建克隆质粒pMD18-T-L1N1、pGEM-T-L2N2及pMD18-T-L3N3。经测序鉴定正确后,将经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的3个NS1基因片段连接至经相同双酶切的pGEX-4T-1原核表达载体,并转化入表达宿主菌BL21（DE3）感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blotting检测重组菌在大肠杆菌中的表达情况。结果表明,成功构建了3段重组原核表达质粒pGEX-4T-L1N1、pGEX-4T-L2N2、pGEX-4T-L3N3,SDS-PAGE结果显示分别表达出大小约57、51、44 ku的目的条带,与预期相符。Western blotting 进一步证实获得的3种蛋白能被ADV阳性血清识别,具有反应原性。本试验首次对ADV NS1基因在大肠杆菌中进行分段表达,为后续研制ADV的亚单位疫苗奠定基础。 相似文献
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为建立绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的原核高效表达体系,本试验设计了扩增JSRV受体Hyal-2基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出Hyal-2全长基因,将该基因定向重组于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,逐步优化条件至稳定表达,经Western blotting检测融合蛋白成功表达后,通过亲和层析法对融合蛋白进行纯化。结果表明,Hyal-2基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1中;经诱导含重组质粒pGEX-4T-1-Hyal-2的表达菌高效表达了带GST标签的目的蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白分子质量为80 ku,与预期大小一致,经Western blotting验证为带GST标签的融合蛋白;通过谷胱甘肽亲和层析法获得纯化的目的蛋白。本试验结果为进一步制备Hyal-2蛋白的多克隆抗体及深入研究其功能奠定基础。 相似文献
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马尔堡病毒核蛋白的原核表达及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
目的以原核表达的方式获得了马尔堡病毒的核蛋白,并纯化。方法将马尔堡病毒核蛋白基因亚克隆到原核表达质粒pET-28(a)中,构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,并将重组质粒用热休克方法转化BL21(DE3)感受态细菌,用IPTG诱导蛋白表达后,以SDS-PAGE分析表达形式及表达量,并利用His-Band Ni+柱纯化。结果成功构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,以1.0mmol/L终浓度的IPTG在37℃诱导表达5h后,破菌沉淀中有目的蛋白表达。结论成功表达并纯化了马尔堡病毒的核蛋白,为后续研究奠定了基础。 相似文献
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为了能够获得刚地弓形虫RH株棒状蛋白ROP54的重组蛋白，本研究进行了弓形虫RH株ROP54蛋白编码基因的生物信息分析及原核表达。运用RT-PCR方法扩增刚地弓形虫RH株ROP54蛋白编码基因序列，并连接至pMD-18-T载体，构建出克隆质粒pMD-ROP54后，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，测序后对基因序列进行生物信息分析。将pMD-ROP54及pET-28a经双酶切及连接，构建出原核表达质粒pET-ROP54,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况，Western blot鉴定重组蛋白的反应原性。结果显示，成功扩增出长度约1 440 bp的ROP54蛋白编码基因序列。生物信息学分析显示，测序结果与刚地弓形虫M49株比对同源性为99%。预测ROP54蛋白氨基酸序列1至26个氨基酸为信号肽，亲/疏水性最小值是-2.978,最大值是2.700。成功构建了原核表达质粒pET-ROP54,IPTG诱导后经，SDS-PAGE结果可见约52.94 kDa大小的蛋白表达，且能够被犬抗弓形虫血清识别，具有良好的反应原性。本研究成功... 相似文献
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SIgA是评价黏膜免疫的重要指标,分泌片(SC)是SIgA的特有成分,为了更方便的获得大量的SIgA的分泌片,本研究应用RT-PCR方法扩增出SC基因片段,将SC基因片段克隆到pGEX-4T-1原核表达载体上,经酶切和测序验证获得pGEX-4T-1-SC重组质粒;将获得的pGEX-4T-1-SC转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达重组蛋白rSC.重组蛋白rSC经鉴定和纯化后,按常规免疫程序制备多克隆抗体;利用Western blot对抗重组蛋白rSC的多克隆抗体进行鉴定.结果显示,该抗体能特异性识别猪初乳中的SIgA免疫球蛋白,而与猪初乳中的IgG不发生反应.因此,抗SC重组蛋白的多克隆抗体可以作为抗SIgA免疫球蛋白的特异性抗体,为进一步建立SIgA的检测方法及黏膜免疫的研究奠定基础. 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2014,(17)
为了提高牛分枝杆菌单一抗原的抗原性,试验采用重叠延伸剪接技术(SOE)将CFP10和ESAT6基因通过(Gly4Ser)3接头连接,得到融合基因CFP10-ESAT6;将其克隆入pGEX-6P-1质粒,构建重组质粒pGEX-6P-1-CFP10-ESAT6;用重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见相应外援蛋白带;最后应用Western-blot检测融合基因。结果表明:试验成功构建携带牛分枝杆菌CFP10-ESAT6融合基因的重组质粒,其表达的融合蛋白具有牛分枝杆菌抗原性。说明CFP10-ESAT6融合蛋白可用于牛结核病感染和免疫抗体的检测,具有良好的开发和应用前景。 相似文献
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为克隆南阳牛BoLA-DRA基因,构建原核表达载体并研究该基因在大肠埃希菌中的表达。从南阳牛脾脏组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到BoLA-DRA基因,将其克隆至pGEM-Teasy克隆载体上,转化感受态细胞DH5α,经测序鉴定后,进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建出重组表达质粒,经IPTG诱导表达。结果表明,本试验成功克隆了大小为917 bp的BoLA-DRA基因,重组质粒pGEX-4T-DRA在大肠埃希菌中以包涵体形式表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为54.4 ku,与预期结果一致。为进一步研究该蛋白的功能及制备抗体奠定了基础。 相似文献
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本研究利用RT-PCR方法扩增鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)奉贤株(FX2010)的结构蛋白E基因,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+),构建重组表达质粒pET32a-E。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE和Western blot试验检测结果表明,E基因在大肠杆菌中得到了表达,并且可与抗DTMUV的多克隆抗体发生特异性反应。E基因的成功表达为DTMUV的诊断试剂盒、疫苗等的研制奠定基础。 相似文献
19.
本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。 相似文献
20.
本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型（PCV3）重组核衣壳（Cap）蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16 ℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。 相似文献