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1.
本试验旨在构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因重组表达载体,并建立稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系。利用RT-PCR方法扩增Asia 1型FMDV的cDNA,获得VP2基因完整的编码区,构建可表达VP2的带有绿色荧光蛋白标记基因的pIRES2-EGFP-VP2重组表达载体。经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染293T细胞,通过Western Blot技术检测VP2蛋白的瞬时表达;然后再转染BHK-21细胞,通过G418筛选,形成单克隆细胞系,经荧光筛选到表达EGFP的抗性单克隆细胞,扩繁培养克隆细胞,再通过West-ern Blot技术检测其VP2的表达,最终筛选到稳定表达FMDVVP2基因的BHK-21细胞系。结果表明,VP2基因重组表达载体pIRES2-EGFP-VP2构建正确,能够在293T细胞内瞬时表达;转染BHK-21细胞,经G418筛选到表达VP2基因的BHK-21细胞克隆,经长达60d的传代,获得了稳定表达VP2基因和EGFP的BHK-21细胞系。上述结果表明,我们建立了稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系,为进一步探讨VP2基因在FMD... 相似文献
2.
根据GenBank中公布的猪O型口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)全基因合成了FMDV结构蛋白前体蛋白P1基因,同时设计了扩增FMDV结构蛋白VP0、VP1和VP3基因的引物。以P1基因为模板,分别经PCR扩增获得FMDV VP0、VP1和VP3基因。扩增产物克隆于Blunt载体中,酶切后将目的片段连接到原核表达载体SUMO中,构建重组表达质粒SUMO-VP0、SUMO-VP1和SUMO-VP3,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳可见融合蛋白均获得高效表达,融合蛋白表观分子质量分别约为55、48和40 ku。在IPTG浓度为1.0 mmol/L,温度为37 ℃,诱导5 h时融合蛋白表达量最大。Western blotting结果表明,融合蛋白均可被FMDV阳性血清识别,反应原性良好。 相似文献
3.
A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原，与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构，所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗，用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫，以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础，在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因，经双酶切及测序鉴定，成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞，拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示，该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明，重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性，插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。 相似文献
4.
AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达 总被引：1，自引：1，他引：0
利用杆状病毒表达系统对Asia Ⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VPl基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白功能及建立Asia Ⅰ型FMDV血清学诊断方法奠定基础.采用PCR方法从pGEM-T-Easy-Asia Ⅰ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFast-BaeHTA-VPl再转入DH10Bae感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Baemid-VPl,然后转染Sf9昆虫细胞.PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Baemid-VP1,SDS-PAGE和West-ern-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白.将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出Asia Ⅰ型口蹄疫病毒阳性血清.Asia Ⅰ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础. 相似文献
5.
设计1对引物将口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)VP1基因克隆到T载体上,通过NdeⅠ和Xho Ⅰ双酶切VP1基因和pET-28(a),在T4连接酶的作用下构建重组表达载体pET-28a-VP1;然后用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切VP1基因与pET-41(a),在T4连接酶的作用下构建重组表达载体pET-41a-VP1;然后将这2个新构建的载体分别通过热冲击法转化BL21(DE3),37℃不同IPTG浓度和32℃、0.01 mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示pET-28a-VP1的表达量高于pET-41a-VP1,在DTT和乙醇的作用下,二者均没有可溶性蛋白出现. 相似文献
6.
《中国兽医杂志》2015,(7)
为研究鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP3蛋白在宿主细胞中的作用,本研究采用PCR技术从CIAV DNA中扩增出vp3基因,并将该基因克隆到p MD18-T simple vector中。经测序证实所克隆的vp3基因与CIAV CUX-1标准株相同。并将vp3基因亚克隆到真核表达载体p EGFP-N1中,构建了重组真核表达质粒p EGFP-vp3与p CMV-Myc vp3,转染BHK-21和293 T细胞,经RT-PCR、荧光显微镜以及Western Blot证实转染的真核细胞能够表达VP3蛋白。以台盼蓝染色法检测细胞死亡,结果表明,VP3蛋白具有较强诱导细胞死亡的作用。该结果为深入研究CIAV的致病机理奠定了基础。 相似文献
7.
利用PCR技术，扩增出口蹄疫病毒（FMDV）VP2基因，并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞，获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后，感染sf9细胞，表达VP2融合蛋白，分子质量为33ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体，通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定，说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达，且可以与牛抗。型FMDV血清发生特异性反应。 相似文献
8.
通过PCR方法分别从含有猪圆环病毒2型(PCV-2)核衣壳蛋白(Cap)基因和猪,γ-干扰素(PoIFN-γ)基因的重组克隆载体pMD18-PCV-2Cap和pMD18-PoIFN-γ中扩增出Cap和PoIFN-γ的基因,将两基因亚克隆到真核表达载体pBudCE4.1中,构建重组真核双表达载体pBud-IFNPCV。重组质粒转染BHK-21细胞后进行Zeocin~(TM)抗性筛选建立细胞系,阳性细胞通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测cap和PoIFN-γ在BHK-21细胞中的表达。结果显示,试验中筛选出1株Zeocin~(TM)抗性阳性BHK-21细胞,cap和PoIFN-γ均在该细胞中获得稳定高效表达,这将为猪圆环病毒病的防治提供新的方法。 相似文献
9.
鹅细小病毒VP2基因原核及真核表达载体的构建 总被引：4，自引：0，他引：4
将鹅细小病毒VP2基因在克隆到原核表达载体pPROEX-HTb及真核转移载体pFASTBAC-HTb中，重组真核转移载体在DH10BAC中经转座作用，成功构建了表达VP2基因的原核表达载体pPROEX-HTb-VP2和杆状病毒表达载体BAC-VP2。经限制性内切酶酶切及PCR分析，确定为阳性重组子。 相似文献
10.
鹅细小病毒VP3与禽分枝杆菌副结核亚种hsp65融合基因真核表达载体的构建及鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
为了构建鹅细小病毒(GPV)的VP3与禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)的hsp65融合基因重组真核表达载体,试验克隆了VP3和hsp65基因,并将二者先后插入真核表达载体pVAX1中,构建重组质粒pVAXl-VP3和pVAXl-hsp65-VP3.酶切和PCR鉴定表明表达载体构建正确,用脂质体将二者分别转染入Vero细胞中,间接免疫荧光检测其在细胞中的表达.结果显示,转染细胞表面可见绿色荧光,说明hsp65、VP3基因表达成功.试验为GPV的DNA疫苗研制及hsp65分子佐剂在动物医学中的应用奠定基础. 相似文献
11.
为研究波形蛋白在病毒侵染过程中发挥的作用,原核表达猪波形蛋白与病毒互感后检测其复制能力。根据GenBank中已发表的波形蛋白序列,设计特异性引物,从PK-15细胞中扩增波形蛋白基因,并将其克隆至pET-28a(+)载体,转化大肠埃希菌BL21进行原核表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,进行目的蛋白的纯化及复性,并利用病毒抑制试验,检测其在病毒感染过程中的作用。结果表明,成功地克隆了猪波形蛋白基因,并克隆至pET-28a(+)载体,经诱导后高效表达,经纯化复性获得的波形蛋白抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)侵染Marc-145细胞,然而并不抑制口蹄疫(FMDV)侵染PK-15细胞。随后借助细胞流式术检测PK-15细胞中波形蛋白的分布,显示其主要存在于细胞膜内的基质中。猪源波形蛋白的克隆表达,为进一步研究猪源波形蛋白与口蹄疫病毒蛋白之间的相互作用奠定了基础。 相似文献
12.
研究菪可轮蒲水煎液对多杀性巴氏杆菌的体内外抑菌活性作用。用传统水煎法制备菪可轮蒲水煎液,用HPLC法测定菪可轮蒲水煎液中龙胆苦苷浓度,并用龙胆苦苷浓度标定复方药物浓度,分别采用牛津杯法和宏量肉汤稀释法测定菪可轮蒲水煎液对多杀性巴氏杆菌的抑菌圈直径和最小抑菌浓度(MIC),通过建立死亡率为75%的多杀性巴氏杆菌体内感染小鼠模型,测定浓度为0.0232mg/mL的菪可轮蒲水煎液,在感染前和感染后给药方式下,分别给予0.1、0.3、0.5mL药物时对小鼠多杀性巴氏杆菌感染的预防和治疗作用。结果显示,菪可轮蒲水煎液浓度为0.0464mg/mL时,对多杀性巴氏杆菌的抑菌圈平均直径为13.5mm,MIC值为0.0029mg/mL,经病理剖检、细菌镜检、全自动微生物鉴定及药敏系统(VITEK2COMPACT)细菌鉴定,表明死亡率为75%的多杀性巴氏杆菌体内感染小鼠模型建立成功,且预防组各组和治疗组各组小鼠死亡率依次为58.3%、41.7%、83.3%、66.7%、58.3%和91.7%。综合以上试验结果,菪可轮蒲水煎液对多杀性巴氏杆菌具有良好的体内外抑菌活性,且其预防作用较治疗作用明显。 相似文献
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病原菌分子生物学诊断技术及其在奶牛子宫内膜炎诊断中的应用进展 总被引：1，自引：0，他引：1
子宫内膜炎(Endometritis)是奶牛常见的生殖系统疾病,影响奶牛的生产性能,给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失。奶牛子宫内膜炎多由病原菌混合感染,若能及时、准确地检测出致病菌,对该病的综合防控至关重要。目前,奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术的相关报道甚少,为进一步研究开发奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术,论文对目前应用于其诊断的PCR技术、环介导等温扩增(LAMP)技术、基因芯片技术等的研究进展进行了综述,并对其应用情况和优缺点进行了分析与总结,以期为奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术研究提供参考。 相似文献
14.
为建立便捷、快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的免疫层析方法,本研究利用G蛋白标记胶体金制备金标垫,以PCV2病毒样颗粒(VLPs)和兔Ig G分别作为检测线与质控线组装胶体金试纸条。检测结果显示,该试纸条与A型塞内卡病毒(SVA)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)等猪其它病毒抗体阳性血清无交叉反应,仅对PCV2抗体阳性血清具有高度的特异性;对PCV 2阳性血清最低检测限为1∶6 400稀释度,敏感性较高;批内、批间变异系数CV均小于5%,重复性较好。试纸条在4℃保存6个月,其特异性和敏感性无明显变化。对采集的100份临床血清样品进行检测,该方法与标准ELISA的总符合率为98%。表明本研究建立的PCV2抗体的胶体金免疫层析检测方法具有敏感、特异、稳定等特点,可以做为评价PCV2疫苗免疫效果及其感染筛查的检测方法。 相似文献
15.
为更准确研究口蹄疫病毒(FMDV)感染猪非结构蛋白抗体变化规律,选取3种不同的试剂盒,分别检测接种O型口蹄疫病毒猪FMDV非结构蛋白3ABC抗体。试验数据表明,人工感染O型口蹄疫病毒猪最早在感染后第5天检测到非结构蛋白抗体,至第7天3ABC抗体全部转为阳性;3种试剂盒检测最早3ABC抗体与症状对应关系有差异,每两种商业试剂盒呈现不同程度的相关性。其中A试剂盒显示出最大的灵敏度,而B试剂盒显示最高的特异性,C试剂盒的敏感性依可疑样品的处理方式而变化,因此对3种试剂盒进行比较,发现A试剂盒更稳定,更适合于猪FMDV非结构蛋白抗体检测。 相似文献
16.
兔抗O型口蹄疫VLPs酶标抗体的制备及初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备兔抗O型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)的酶标抗体,进一步建立O型口蹄疫病毒的ELISA检测方法,通过原核表达、体外纯化和组装O型口蹄疫VLPs,免疫家兔制备兔抗O型口蹄疫VLPs高免血清,并采用亲和层析法纯化IgG,改良过碘酸钠法制备兔抗O型口蹄疫VLPs的酶标抗体(rabbit anti-type O foot-and-mouth disease IgG-HRP)。结果显示,兔抗O型口蹄疫VLPs高免血清效价达1∶4 096,纯化后的IgG纯度达90%,效价达1∶512 000。表明获得了高纯度的兔抗O型口蹄疫VLP的酶标抗体,可用于O型口蹄疫的ELISA检测。 相似文献
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为了比较阳起石、菟丝子、淫羊藿对肾阳虚模型大鼠的治疗效果,通过肌肉注射氢化可地松制作了肾阳虚大鼠模型,并在3种药物治疗前后分别对体质量、脏器指数、子宫角长度、子宫中段外径、激素水平及其受体基因的表达情况进行了比较研究。结果显示,阳起石、菟丝子、淫羊藿均能够显著增加大鼠的肝脏指数,提高大鼠黄体生成素、卵泡刺激素、雌激素及激素受体的表达水平,其中阳起石与菟丝子对激素分泌的调节优于淫羊藿,而阳起石与淫羊藿对激素受体表达的调节优于菟丝子。结果表明,这3种药物能通过促进激素分泌和激素受体的表达来改善肾阳虚动物子宫和卵巢的功能,且3种药物的疗效各有优势。 相似文献
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阐明产苦马豆素(swainsonine,SW)疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis中SW的生物合成通路,可以为生物发酵获得大量SW用于抗肿瘤应用和疯草的脱毒育种奠定理论基础和技术支撑。采用不同作用剂量的化学诱变剂亚硝基胍,在28℃,120r·min-1与Alternaria Section Undifilum oxytropis孢子悬液分别作用5、10、15、20、25、30min,选取生长良好的菌株接种PDA培养基,连续培养发酵24d,应用α-甘露糖苷酶活性分析法检测菌丝及发酵液中SW含量,评价其传代及产SW稳定性。联合使用玻璃珠、液氮破壁法预处理菌丝,选用真菌基因组提取试剂盒提取原始菌株和突变株D4基因组DNA,经纯化、酶切、构建菌株DNA文库,并应用荧光定量PCR法检测评价文库构建质量,利用Ion torrent PGMTM测序平台进行突变株和原始株高通量全基因组测序。结果表明,经化学诱变成功获得1株突变株D4,利用MIRA软件对高通量测序序列拼接、组装,分别获得突变株D4和原始株相关基因组片段19、21条,经BLAST、GO分析,注释到AlternariaSection Undifilum oxytropis生物合成SW的关键基因SwnK、SwnH2、SwnH1、SwnR和关键酶putative amino acid transporter、pyrroline-5-carboxylate reductase、formate/glycerate dehydrogenase catalytic、saccharopine reductase-like protein,并结合KEGG数据库,预测了AlternariaSection Undifilum oxytropis产SW可能的生物合成通路。本研究为揭示AlternariaSection Undifilum oxytropis生物合成SW机制作出了新的探索尝试。 相似文献
19.
为了满足我国现阶段猪伪狂犬病病毒(PRV)高频突变引发新疫情诊断的需求,本实验通过生物信息学分析比较,设计合成了针对PRV g B糖蛋白高度保守的抗原优势表位区肽段,命名为g B872。以此肽段为包被抗原,经条件优化建立了新型的PRV-g B间接ELISA抗体检测方法。该ELISA方法检测结果显示,其仅对PRV血清检测为阳性,而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒(O型)、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无交叉反应,表明该方法具有较强的特异性;最低检测下限血清稀释度为1∶128,高于IDEXX PRV/ADV g B抗体检测试剂盒检测下限稀释度(1∶4),表明该方法敏感性高;批内、批间重复性试验结果显示,变异系数均低于10%,重复性良好。利用该方法与Bio Chek PRV-g B抗体检测试剂盒检测90份临床血清样品,对比结果分析显示,两者阳性符合率为100%,阴性符合率为97.67%,总体符合率为97.78%;同时,采用该方法与IDEXX-g I(gE)和IDEXX-g B试剂盒分别对野毒感染血清和疫苗免疫血清同时检测,该方法可以准确识别野毒阳性血清和疫苗免疫阳性血清,与IDEXX两种试剂盒的结果一致。本研究建立的间接ELISA检测方法对PRV疫苗免疫效果评价、流行病学调查及防控提供了可靠的方法。 相似文献
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利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。分离山羊外周血淋巴细胞,提取基因组Total RNA,一步RT-PCR获得完整ORF的SLAM基因,采用BP及LR位点的基因重组技术,构建入门载体pDONR/SLAM并获得表达骨架pDEST/SLAM,与Packaging Mix pLP1、pLP2及VSV-G共转染293-FT细胞,获得SLAM复制缺陷型慢病毒样粒子,用其感染Vero细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过靶标基因扩增、间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、Western blot免疫印迹检测技术、致细胞病变效应及Realtime RT-PCR等技术分别验证SLAM基因组整合、转录,SLAM蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达SLAM阳性细胞亚克隆上的增殖效果。结果显示:SLAM受体基因被稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,该受体蛋白表达于细胞周质,建立的细胞连续传代不丢失,接种病毒后致细胞病变时间由4～7d缩短为3.5d,TCID50·0.1mL-1由4.25增加为5.67,相对于正常Vero细胞,整合有SLAM的Vero细胞,由于表达了PPRV特异的细胞受体使PPRV对其易感性显著增强。成功建立一株稳定表达靶向增强PPRV复制的Vero/SLAM细胞:该细胞表达的SLAM具有明显增强PPRV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明增强PPRV复制的关键靶基因,也为PPRV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等提供研究工具。 相似文献