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1.
《中国兽医学报》2017,(2):254-257
PCR扩增牛源犬新孢子虫NcAMA1基因,克隆至pMD18-T simple载体;将鉴定正确的NcAMA1基因亚克隆至pCR259腺病毒穿梭载体,构建重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcAMA1;依次转化HighQ-1Transpose-AdTM294和HighQ-1TM感受态细胞,构建NcAMA1基因重组腺病毒表达质粒T294-NcAMA1;PacⅠ酶线性化后,脂质体介导转染至QBI-HEK293细胞,包装Ad5-NcAMA1重组腺病毒。结果表明,获得Ad5-NcAMA1重组腺病毒滴度为5.6×109 TCID50/mL;经PCR检测到重组腺病毒NcAMA1基因;经IFAT和Western blot检测NcAMA1基因在QBIHEK293细胞中获得表达,表达蛋白相对分子质量为68 000,具有较好的反应原性。本试验成功构建了Ad5-NcAMA1重组腺病毒,为牛源犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定基础。 相似文献
2.
应用PCR技术扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,纯化PCR产物后与克隆载体pMD18-T Simple Vector连接,将PCR、酶切鉴定及测序分析正确的pMD-18T-NcSRS2重组质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭载体pCR259中,再将PCR、酶切鉴定正确的pCR259-NcSRS2重组质粒转染293细胞,应用IF-AT和Western-blotting技术检测重组质粒在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227bp,与GenBank中发表的NcSRS2（AF061249）核苷酸序列同源性为99%,构建的pCR259-NcSRS2重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,表达蛋白的相对分子质量为43 000,具有较好的反应原性。本试验为新孢子虫病腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。 相似文献
3.
为构建新孢子虫和弓形虫AMA1基因重组腺病毒,并分析其免疫原性,本试验根据新孢子虫和弓形虫AMA1基因序列的开放阅读框,设计新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因通用引物,构建重组克隆质粒pMD18T-NcAMA1、pMD18T-TgAMA1及重组腺病毒穿梭质粒ADV4-Nc/TgAMA1,将ADV4-Nc/TgAMA1和骨架质粒pacAd5线性化后共转染293T细胞,包装Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒,测定病毒滴度后,收集病毒液接种BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体水平。结果显示,Nc/TgAMA1在Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒中获得表达,测定Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒滴度为109PFU/mL,接种BALB/c小鼠后,Ad5-Nc/TgAMA1接种组IgG抗体水平明显高于pVAX1-Nc/TgAMA1质粒组和PBS对照组。结果表明,构建的Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。本试验为新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
4.
为了确定牛源犬新孢子虫NcGRA9基因的功能及表达蛋白的免疫原性，本试验PCR扩增牛源犬新孢子虫NcGRA9基因，构建克隆质粒pMD18-T-NcGRA9和原核表达质粒pGEX-4T-NcGRA9,转化大肠杆菌BL21感受态细胞中IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达重组蛋白的反应原性，应用重组蛋白与弗氏佐剂混合接种BALB/c小鼠，ELISA检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平以及IFN-γ、IL-4细胞因子水平。结果显示，经PCR扩增获得522 bp的NcGRA9片段，表达蛋白纯化后相对分子质量约为45 kDa,具有良好的反应原性；重组蛋白接种BALB/c小鼠后，免疫组小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体水平以及IFN-γ、IL-4细胞因子水平均极显著高于PBS对照组(P<0.01),说明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验表达的NcGRA9重组蛋白具有良好的抗原性，为新孢子虫病的防控奠定了基础。 相似文献
5.
《中国兽医学报》2014,(12):1931-1934
为构建犬新孢子虫NcSRS9基因真核表达重组质粒,了解NcSRS9表面蛋白基因的生物学特性及其体外表达情况。本试验应用PCR技术获得目片段,构建克隆质粒pMD18-NcSRS9,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后构建真核表达重组质粒pVAX1-NcSRS9,利用脂质体介导法转染至Vero细胞,以间接免疫荧光方法(IFAT)检测NcSRS9基因在Vero细胞中的表达。结果显示,犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS9基因长度为1 191bp,与GenBank中(EF440644.1)发表的基因核苷酸序列同源性为99%,IFAT检测NcSRS9基因在Vero细胞中获得瞬时表达,为核酸疫苗研究奠定了基础。 相似文献
6.
为了解牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7融合基因的生物学特性,本试验提取牛源犬新孢子虫基因组DNA,应用PCR技术扩增犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS2和致密颗粒蛋白基因NcGRA7,SOE-PCR技术拼接NcSRS2和NcGRA7基因,构建NcSRS2-NcGRA7融合基因重组克隆质粒,并进行PCR鉴定、双酶切鉴定及生物信息学分析。结果,NcSRS2基因扩增片段大小为1 061 bp,NcGRA7基因扩增片段大小为364 bp,NcSRS2-NcGRA7融合基因扩增片段大小为1 482 bp;获得重组克隆质粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7经PCR鉴定、双酶切鉴定正确;测序分析表明,与Gen-Bank中已发表的美国株犬新孢子虫(AF061249、AF176649)核苷酸序列同源性为99%;经DNAman等软件分析,预测NcSRS2-NcGRA7融合蛋白抗原指数较高,融合蛋白二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,三级结构中2种蛋白独立折叠,并借助Linker互相连接,功能互不影响。本试验为牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7融合蛋白的免疫学研究奠定了基础。 相似文献
7.
试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒并分析评价其免疫效果。将重组克隆质粒pMD-19T-ENO与腺病毒穿梭载体AdV4-GFP分别进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO;将经PacⅠ酶线性化后的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO转染293细胞,获得重组腺病毒Ad4-M/ENO,采用PCR和间接免疫荧光试验(IFTA)鉴定猪附红细胞体ENO基因在293细胞中的表达,再对293细胞进行培养,测定重组腺病毒的滴度;将30只BALB/c小鼠分为3组:重组腺病毒Ad4-M/ENO组、AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组,分别进行免疫接种,采用ELISA方法检测血清中猪附红细胞体IgG、IgG_1、IgG_(2a)抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平,在三免2周后检测小鼠脾脏中CD4~+和CD8~+含量。结果显示,构建的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO目的基因片段大小为1 182 bp;重组腺病毒Ad4-M/ENO包装成功,能在293细胞中表达,滴度为1×10~9 PFU/mL。经重组腺病毒Ad4-M/ENO免疫后的BALB/c小鼠血清中IgG、IgG_1、IgG_(2a)抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD4~+、CD8~+含量均显著或极显著高于AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组(P0.05;P0.01)。结果表明,本试验成功构建了表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒,且该重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答反应。 相似文献
8.
为了解牛新孢子虫NcSRS2基因的生物学特性,试验扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,亚克隆至pMD18-T载体后进行PCR鉴定、酶切鉴定及测序分析,最后克隆至pVAXⅠ真核表达载体中,并进行PCR鉴定和酶切鉴定。结果表明:牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227 bp,与GenBank中发表的NcSRS2(AF061249)核苷酸序列同源性为99%;构建的真核重组质粒pVAXⅠ-NcSRS2正确。 相似文献
9.
为了解腺病毒穿梭载体介导NcSAG1基因在293细胞中的表达情况,本试验应用PCR技术扩增牛源新孢子虫NcSAG1基因,构建pMD-18T-NcSAG1克隆质粒和腺病毒重组穿梭质粒pCR259-NcSAG1,将鉴定正确的pCR259-NcSAG1重组质粒转染293细胞,应用免疫荧光试验(IFA)和Western blot技术检测pCR259-NcSAG1重组质粒在293细胞中的表达。结果显示:扩增的牛源新孢子虫NcSAG1基因长度为982 bp,与GenBank中发表的NcSAG1(AF132217)核苷酸序列同源性为99%,IFA检测构建的pCR259-NcSAG1重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,Western blot分析表达蛋白的分子量为33 ku,具有较好的反应原性。本试验为NcSAG1腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。 相似文献
10.
试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒并分析评价其免疫效果。将重组克隆质粒pMD-19T-ENO与腺病毒穿梭载体AdV4-GFP分别进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO;将经PacⅠ酶线性化后的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO转染293细胞,获得重组腺病毒Ad4-M/ENO,采用PCR和间接免疫荧光试验（IFTA）鉴定猪附红细胞体ENO基因在293细胞中的表达,再对293细胞进行培养,测定重组腺病毒的滴度;将30只BALB/c小鼠分为3组：重组腺病毒Ad4-M/ENO组、AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组,分别进行免疫接种,采用ELISA方法检测血清中猪附红细胞体IgG、IgG1、IgG2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平,在三免2周后检测小鼠脾脏中CD4+和CD8+含量。结果显示,构建的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO目的基因片段大小为1 182 bp;重组腺病毒Ad4-M/ENO包装成功,能在293细胞中表达,滴度为1×109 PFU/mL。经重组腺病毒Ad4-M/ENO免疫后的BALB/c小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD4+、CD8+含量均显著或极显著高于AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组（P<0.05;P<0.01）。结果表明,本试验成功构建了表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒,且该重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答反应。 相似文献
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LI Hang JIANG Li-jian LIU Jin-yu LAN Lan LING Fang-fang SHI Tian-tian ZHANG He-yang JIA Li-jun 《中国畜牧兽医》2016,43(12):3336-3342
In order to establish AMA1 recombinant adenovirus of Neospora caninum (N.caninum) and Toxoplasma gondii (T.gondii), and analyze the immunogenicity of it, cross universal primers were designed according to the open reading frame of N. caninum and T. gondii AMA1 gene sequences. Based on pMD18T-NcAMA1 and pMD18T-TgAMA1 cloning plasmid, recombinant adenovirus shuttle plasmid ADV4-Nc/TgAMA1 was constructed. Then, ADV4-Nc/TgAMA1 and pacAd5 backbone plasmid were linearized and co-transfected 293T cells. After packaging recombinant adenovirus and measuring the virus titer, collected virus was inoculated into BALB/c mice, confirmed the IgG antibody levels by indirect ELISA method. The results showed that Nc/TgAMA1 was expressed in Ad5-Nc/TgAMA1 recombinant adenovirus, Ad5-Nc/TgAMA1 recombinant adenovirus titer was 109 PFU/mL. IgG antibody levels in the Ad5-Nc/TgAMA1 vaccinated group were significantly higher than pVAX1-Nc/TgAMA1 plasmid group and PBS control group. This result indicated that the constructed Ad5-Nc/TgAMA1 recombinant adenovirus could induce specific humoral immune response in mice, this research laid a solid foundation for the development of a recombinant adenovirus vaccine against N. caninum and T. gondii. 相似文献
12.
为了解新孢子虫NcSRS9基因的生物信息学特性,本试验对牛源犬新孢子虫吉林株NcSRS9基因进行分子克隆,利用生物信息学软件对该基因进行编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析,并将该基因片段亚克隆至原核表达载体pET-28α,构建了重组表达质粒pET-28α-NcSRS9,转化至大肠杆菌BL21中并诱导表达。结果显示,克隆的NcSRS9基因片段长969bp,与GenBank（EF440644.1）上发表的基因序列同源性100%。NcSRS9基因编码蛋白等电点为5.12,在其N末端存在一个跨膜区。SDS-PAGE和Western-blotting分析显示,NcSRS9基因在大肠杆菌内得到高效表达,表达的NcSRS9重组蛋白相对分子质量约为43 000（His约为7 000,NcSRS9约为36 000）,可被牛抗新孢子虫阳性血清识别,说明表达的蛋白具有一定的反应原性。 相似文献
13.
为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒活载体疫苗,本研究将PRRSV GP5和M基因串联表达盒定向克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA多克隆位点处,获得重组穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-GP5-M,与骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染293AD细胞,包装出含有GP5和M基因的重组腺病毒rAd5-GP5-M。应用PCR技术、间接免疫荧光、Western blot分析,结果表明,GP5和M基因已经被成功整合到了腺病毒基因组上,且GP5和M蛋白在293AD细胞上均得到了表达;滴度测定表明,该重组腺病毒rAd5v-GP5-M的TCID50为10-6.5/mL;连续传代试验表明该重组腺病毒可在细胞内稳定繁殖,有效地转录并表达GP5和M蛋白,具有较高的遗传稳定性。该研究为PRRSV重组腺病毒疫苗的研制打下了基础。 相似文献
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表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
15.
猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株E2蛋白的表达及抗体制备 总被引：1，自引：0，他引：1
表达去除SD0803E2基因跨膜疏水区的sE2蛋白并制备其抗体,为猪源BVDV诊断奠定基础。RT-PCR扩增SD0803株sE2基因,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-sE2,转化BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光等方法鉴定获得的抗体。结果显示,抗体效价最高可达1∶256 000;制备的抗体可与rsE2蛋白特异性结合;该抗体可特异性识别BVDV感染MDBK细胞表达的E2蛋白,显示抗体高度的特异性。成功构建pGEX-4T-1-sE2原核表达质粒,诱导其表达的蛋白免疫家兔,成功制备的猪源BVDV SD0803株E2抗体。 相似文献
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Nishikawa Y Claveria FG Fujisaki K Nagasawa H 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》2002,64(2):161-164
The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to examine cross-reactivity of Neospora caninum with Toxoplasma gondii and Hammondia heydorni. Anti-T. gondii mouse and cat sera cross-reacted with N. caninum soluble antigen (NLA), but not with the recombinant surface antigen (NcSRS2). Anti-H. heydorni dog sera showed no cross-reactivity with either the NLA antigen or the NcSRS2. Lack of cross-reactivity between anti-H. heydorni sera and N. caninum antigens, and the cross-reactivity of anti-T. gondii sera with the NLA suggest that N. caninum has common antigens to T. gondii except for NcSRS2 based on serology. In light of several studies suggesting a closer relationship between N. caninum and H. heydorni than with T gondii, examination of serological cross-reactivity with N. caninum may be necessary to further classify the parasites in addition to molecular and morphological studies and clarification of the life cycle. 相似文献