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1.
家蚕Polh+ Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建 总被引：5，自引：4，他引：1
为利用杆状病毒的强启动子——多角体启动子而构建的重组杆状病毒一般是多角体缺失型(polh-)病毒。为了解决家蚕生物反应器规模化生产中病毒必需经皮接种而效率低下的问题,在建立家蚕Bac-to-Bac快速表达系统的基础上,构建了能形成多角体的家蚕Polh+ Bac-to-Bac表达系统。通过该系统能够产生表达外源目的基因的重组病毒,获得的该重组病毒能在培养细胞内表达,也能通过经口添食感染表达。利用EGFP报告基因分析了该系统的表达效果,构建的重组病毒不仅有效表达了EGFP蛋白,还在细胞核中形成了大量多角体。该系统较好解决了重组病毒必需经皮接种感染的缺陷,提高了生产效率,拓宽了杆状病毒在生物杀虫剂、基因治疗等领域的应用前景。 相似文献
2.
瘦素(leptin)蛋白由肥胖基因编码,对人体能量代谢等多种生理过程起着重要的调节作用。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人瘦素蛋白基因(lep)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,并转化E.coli DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-lep,然后转染家蚕BmN细胞,获得重组杆状病毒。用SDS-PAGE和Western blotting方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞检测到大小约22 kD的蛋白条带,与预期的人瘦素蛋白分子质量相符。给家蚕5龄起蚕注射重组病毒液后的4～5 d出现发病症状,RT-PCR检测发病家蚕的血液中有lep基因转录,并通过SDS-PAGE和Western blotting检测到大小为22 kD的人瘦素蛋白的表达。研究结果表明,利用Bac-to-Bac表达系统能够获得含有人瘦素蛋白基因的重组杆状病毒,并且目的蛋白能在家蚕细胞及幼虫体内表达。 相似文献
3.
人生长素是由腺垂体分泌的一种在人体生长、发育及代谢中发挥重要作用的激素,具有广泛的生理作用。利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bac-to-Bac表达系统,将人生长素基因(hgh)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,通过细菌转座子原理,转化BmDH10Bac细胞,获得重组穿梭载体质粒Bacmid-hgh,并将其转染家蚕BmN细胞,获得含有hgh的重组杆状病毒。将此重组病毒感染家蚕BmN细胞,收集重组病毒液并穿刺接种家蚕5龄起蚕,3 d后观察到家蚕感染了杆状病毒的症状,并通过SDS-PAGE和Western blotting方法在家蚕血液中检测到分子质量约20 kD的目的蛋白,表明人生长素通过Bac-to-Bac系统在家蚕体内获得了表达。 相似文献
4.
《蚕业科学》2016,(6)
DNA复制是杆状病毒生活史中最重要的事件,其中DNA聚合酶是病毒复制过程的关键酶。从家蚕杆状病毒(Bm NPV)基因组PCR扩增获得DNA聚合酶基因Bm NPV-pol的序列,利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒v Bm NPV-POL,并感染家蚕5龄幼虫,通过SDS-PAGE和Western blotting检测重组Bm NPV-POL蛋白在蚕体内成功表达,经Ni-NTA柱纯化获得了纯度较高的重组Bm NPV-POL蛋白。以poly(d A)/oligo(d T)为模板,比较在原核细胞和家蚕杆状病毒表达系统获得的重组Bm NPV-POL蛋白的酶活性,结果表明在家蚕幼虫体内表达并纯化的重组Bm NPV-POL的酶活性明显较高。利用家蚕杆状病毒表达系统简便、快速获得重组Bm NPV-POL蛋白,有助于后续对Bm NPV复制机制的研究。 相似文献
5.
杆状病毒Bac-to-Bac表达系统由于操作简便等优点,被广泛应用于外源蛋白的表达。利用新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac系统可溶性表达一个大分子质量的融合蛋白———piwi相关基因编码蛋白PRG-1。为了提高目的蛋白的表达量,对重组病毒感染剂量及产物收获时间进行优化,并利用GST亲和层析纯化融合蛋白。结果表明在家蚕卵巢培养细胞BmN中表达的重组GST-PRG-1是可溶性蛋白;最佳的感染条件是病毒粒子对BmN细胞的感染复数(MOI)=1,并在感染后96 h收获细胞。试验结果表明,新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统可用于大分子蛋白的可溶性表达。 相似文献
6.
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利用双色荧光观察分析重组家蚕杆状病毒对昆虫细胞及蚕体组织的感染 总被引：2，自引：1，他引：1
尝试将红色荧光蛋白(RFP)作为昆虫表达体系的分子标签,克隆了rfp基因的读码框,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将该基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)中,获得重组杆状病毒BmNPV-rfp。对家蚕细胞的感染表明,rfp适于在昆虫细胞中表达,在显微镜下红色荧光很明显,说明RFP可以作为杆状病毒表达的分子标签。BmNPV-rfp和另一种插入绿色荧光蛋白基因gfp的家蚕重组杆状病毒BmNPV-gfp混合感染家蚕细胞和幼虫的实验表明,二者的荧光很少在同一细胞中发生重叠,说明昆虫细胞大多只感受1次同一来源的病毒。BmNPV-rfp、BmN-PV-gfp与AcNPV混合感染Sf21细胞的结果也证明了该推断,并且还显示AcNPV可以协助BmNPV来源的病毒基因在Sf21细胞中表达以及协助病毒增殖或产生杂交病毒,但尚未明确其机制。 相似文献
8.
利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在家蚕表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的E蛋白和M蛋白 总被引：2，自引：0，他引：2
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业的传染性病原。PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白基因是开发PRRSV病毒新型疫苗的目标基因。利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,将PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,获得重组转移质粒pFastBacHTb-E和pFastBacHTb-M,转化大肠杆菌Bm DH10 Bac感受态细胞,获得重组杆粒BmNPV Bacmid-E、BmNPV Bacmid-M,将这些重组杆粒转染家蚕培养细胞Bm5,获得重组病毒BmNPV-E和BmNPV-M。将2种重组病毒分别接种5龄起蚕,用SDS-PAGE和Western blotting方法在重组Bacmid DNA转染的Bm5细胞和感染重组病毒的家蚕幼虫血细胞中分别检测到分子质量约20 kD和18 kD的E蛋白和M蛋白,表明PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白在家蚕培养细胞及幼虫体内获得了表达,为利用家蚕-杆状病毒表达系统研制PRRSV的新型疫苗与诊断试剂奠定了基础。 相似文献
9.
为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedro virus,BmNPV)中GP41蛋白的包装功能,从BmNPV基因组中克隆了gp41基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-gfp中,构建重组转移载体pFastBac1-gp41-gfp,再利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒,在家蚕BmN细胞系中进行融合表达和定位分析。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,经重组杆状病毒r-gp41-gfp感染的BmN细胞新增一条大小为65 kD左右的蛋白条带,证明该融合蛋白在BmN细胞中成功表达。用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光充满于细胞质中,不能形成聚集体。与野生型BmNPV混合感染的实验也表明荧光出现的位置与多角体无关,说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面,融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。 相似文献
10.
人CD28分子是T细胞表面的最重要的协同刺激分子。将抗人CD28的鼠源单链抗体基因(mouse anti-human CD28-ScFv)亚克隆至杂交病毒HyNPV Bac-to-Bac系统供体质粒pFastBacHTa中,获得重组转移载体pFast-BacHTa CD28-ScFv,并转化大肠杆菌(E.coli)DH10Bac获得重组杆粒rBacmid CD28-ScFv,脂质体介导转染Sf9昆虫细胞后获得重组杆状病毒rBV CD28-ScFv。该重组杆状病毒注射接种于家蚕5龄起蚕,经SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,CD28-ScFv在家蚕体内得到了表达,即:人CD28单链抗体通过HyNPV这一宿主范围扩大的新型杂交杆状病毒表达载体在家蚕中获得了表达。 相似文献
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利用细菌转座子构建适于家蚕的Bac-to-Bac快速基因表达系统 总被引：9，自引：6，他引：3
为了较好地解决家蚕杆状病毒基因表达系统(BmNPV expression system)在重组病毒构建和纯化过程中存在的重组率低、空斑分析技术繁琐、花费时间长等缺点,借鉴国外AcNPV Bac-to-Bac快速基因表达系统工作原理,对家蚕BmNPV基因组进行了改造。通过同源重组的方法,将含有单拷贝数细菌F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点、编码LacZα肽的部分DNA片段和抗性选择标记基因的基因片段重组入家蚕BmNPV基因组,替换多角体蛋白基因,获得了家蚕BmNPV病毒穿梭载体BmBacm id;并利用供体质粒上的表达盒和细菌转座子以及细菌转座子的基因定位转移作用,在细菌体内实现外源目的基因向家蚕BmNPV基因组上的转移整合,快速完成重组BmN-PV病毒的构建。 相似文献
13.
利用PCR反应，以特异性引物扩增禽流感病毒去除信号肽的H7亚型HA密码子优化基因，克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTB中，转座DH10感受态细胞，通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆，然后提取基因组Bacmid，转染Sf9昆虫细胞，得到含H7亚型流感病毒HA基因的重组杆状病毒opti-H7HA-Bac。重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞，待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞，细胞裂解产物经血凝试验、SDS-PAGE及Western blot分析证实，密码子优化的H7HA基因在重组杆状病毒opti-H7HA-Bac感染Sf9细胞后获得高效表达，且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。 相似文献
14.
本文以嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得IBV非结构蛋白5(non-structural protein,nsp5)基因片段后,构建了杆状病毒重组质粒IBVnsp5-Bacmid。IBVnsp5-Bacmid转染Sf9细胞,获得nsp5重组杆状病毒,经(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot检测到转染细胞表达的nsp5蛋白。进一步从感染的细胞中纯化重组蛋白,并用纯化的蛋白免疫小鼠制备了抗nsp5的多抗血清,该多抗血清可检测到IBV四川株SC021202感染的DF-1细胞中特异性的nsp5蛋白。结果表明IBV nsp5在Bac-to-Bac真核表达系统中获得了成功表达,而且具有良好的免疫原性和反应原性。 相似文献
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以杆状病毒Bac-to-Bac表达系统表达猪瘟病毒(CSFV)石门株的E2蛋白,将CSFV石门株的E2囊膜糖蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得重组转移质粒pFastBacHTA-E2。转化大肠埃希菌DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒。传毒3代后对表达蛋白进行Western blot和间接免疫荧光试验检测。结果显示,E2蛋白获得高效表达,能被抗E2蛋白的单克隆抗体2B10和6×His-单克隆抗体特异性识别,表明CSFV石门株E2囊膜糖蛋白在Sf9昆虫细胞中得到成功表达,具有良好的抗原反应性。 相似文献
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本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。 相似文献