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1.
【背景】山羊第一卵泡波中的优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）是整个卵泡发育过程中最为关键的两个阶段。随着卵泡的进一步发育,最终DF可能发育成为成熟卵泡,直到排卵;SF将走向闭锁,其中颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的关键因素。然而目前对促进卵泡的优势化或导致其闭锁的分子机理尚不清楚。【目的】通过对山羊第一卵泡波中DF和SF颗粒细胞进行高通量测序,旨在筛选影响卵泡发育的关键基因,为深入探究卵泡发育的调控机制提供理论依据。【方法】选取10只1岁龄健康的贵州白山羊分别注射前列腺素F2α,使其同期发情,此后每天用B超检测并记录卵泡的生长情况,发情3 d后,统一屠宰并采集第一卵泡波中DF (直径4.5—6 mm)与SF (直径3 —4.5 mm),分别分离其中的颗粒细胞,提取总RNA、构建文库后通过Illumina Hiseq 2500平台进行测序。利用FastQC对测序产出raw reads进行质量评估并经过过滤后,获得品质较高的clean reads;使用Trinity对得到的clean reads进行重新组装,从而获得unigenes;使用CLC Genomics Workbench将unigenes与山羊RefSeq数据库进行比对获得mRNA;使用DESeq2 软件对获得的mRNA进行差异表达分析;分别采用goseq和kobas软件对得到的差异表达基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最终通过qRT-PCR对筛选出的可能影响卵泡发育的关键基因进行验证。【结果】分别对测序得到的raw reads进行过滤后,在DF颗粒细胞中获得43 217 934条clean reads,占raw reads的比例为95.19%;SF颗粒细胞中获得40 766 348条clean reads,占raw reads的比例为95.35%。将得到的unigenes与山羊的RefSeq 数据库进行比对后,共得到33 896条带有注释的转录本,再通过设定FPKM>1, q value<0.05,共在两种卵泡颗粒细胞中获得13 644个基因。设定参数：FPKM≥1,SF-FPKM/DF-FPKM>1,P<0.05,获得695个差异表达mRNA,其中233个在SF颗粒细胞中表达显著上调,462个表达显著下调;对所获得695个差异表达mRNA进行GO功能富集分析,共分为三大类42组：其中生物学过程占47.6%,细胞组分占47.6%,分子功能占4.8%;KEGG信号通路分析,发现20条通路,其中与核糖体通路相关的基因富集最为显著。通过在Genecard中进行功能分析后,筛选6个可能与山羊卵泡发育密切相关的基因,其中PRLR、PTX3、RGN在SF颗粒细胞中表现为上调;DKK3、ALDH1A2、RARRES1则表现为下调。qRT-PCR显示PRLR、RGN、DKK3、ALDH1A2、RARRES1的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在从属卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于优势卵泡（P<0.01）;DKK3、ALDH1A2、RARRES1在优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于从属卵泡（P<0.01）。【结论】DKK3、ALDH1A2、RARRES1和RGN在优势卵泡和从属卵泡中表达量存在极显著差异,推测在山羊卵泡发育过程中可能促进卵泡的优势化或导致闭锁,对深入探究卵泡发育的调控机制具有重要意义。 相似文献
2.
【目的】对山羊优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF)颗粒细胞进行高通量测序,筛选并研究与山羊卵泡发育相关的下调基因。【方法】以1岁龄贵州白山羊为供试对象,在其发情3 d后,采集第一卵泡波中的优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF),分别分离其颗粒细胞,提取RNA并进行文库构建、Illumina测序,将获得的序列与山羊的RefSeq数据库进行比对后,用DESeq2软件对获得的RNA进行差异表达分析,并对表达下调的基因进行GO分析和KEGG信号通路分析,最后通过Real-time PCR对筛选出的表达下调基因进行验证。【结果】将测序结果与山羊的RefSeq数据库比对后,共获得了33 896个基因。经DESeq2软件对获得的mRNA进行差异表达分析,共获得695个差异表达m-RNA,其中462个表达显著下调,233个表达则显著上调;对462个表达下调基因进行GO分析,共分为2大类39组,其中参与生物学过程(BP)的基因占48.7%;与细胞组分(CC)有关的基因占51.3%。KEGG信号通路分析发现20条通路,其中参与癌症通路基因富集最为显著。从下调基因中筛选出6个可能会抑制山羊卵泡发育的基因,分别为PTX3、LDLR、RGN、NID1、PDLIM5、PRLR。Real-time PCR结果显示,RGN、NID1、PDLIM5、PRLR在SF与DF中的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在SF颗粒细胞中的表达量极显著高于DF(P0.01),NID1、PDLIM5在SF颗粒细胞中的表达量显著高于DF(P0.05);PTX3、LDLR在SF与DF中表达量与高通量测序结果相反。【结论】获得的6个表达下调基因在山羊卵泡发育过程中可能会抑制卵泡的发育,最终导致卵泡闭锁。 相似文献
4.
为研究牛卵泡发育过程中促进卵泡生长成为优势卵泡的重要调控因子及其表达模式,采集牛卵巢上的最大卵泡(8～10 mm)与第二大卵泡(5～8 mm),通过测定卵泡液中雌二醇(E_2)与孕激素(P)的水平,确定优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF)。刮取DF和SF中的颗粒细胞,提取其总RNA并建立文库,通过Illumina平台进行测序。用SOAP V2.0软件将测序获得的序列与牛参考基因组数据库进行比对,获得mRNA序列;用DESeq 2软件对获得的mRNA进行差异表达分析,并对其中表达上调的基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最后通过实时荧光定量PCR对筛选出的具有代表性的上调表达基因进行验证。通过测序共获得32 346个基因,其中在DF颗粒细胞中表达显著上调的基因有194个。GO分析结果显示,这些表达上调的基因共分为3大类33组,其中参与生物学过程(Biological process)的基因占60.6%;与细胞组分(Cellular component)相关基因占21.2%,其中31个基因参与了细胞质功能;与分子功能(Molecular fuction)相关的基因占18.2%,其中18个基因参与金属离子结合。KEGG信号通路分析共发现4条通路,其中基因富集最为显著的是轴突导向通路。实时荧光定量PCR结果表明,细胞色素P450 19A1基因(CYP19A1)在DF颗粒细胞中的相对表达量极显著高于SF(P0.01),硫氧还蛋白结合蛋白(TXNIP)、脑表达X2(BEX2)和丝氨酸蛋白酶35(PRSS35)基因在DF颗粒细胞中的相对表达量显著高于SF(P0.05),与Illumina测序表达趋势一致。综上,PRSS35、CYP19A1、BEX2和TXNIP在牛卵泡的发育过程中可能会起促进作用,最终引起卵泡排卵。 相似文献
5.
转录组测序筛选牛卵泡发育相关基因及其表达差异分析 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】通过不同生理状态牛卵泡高通量测序筛选与卵泡发育相关的基因。【方法】母牛同期发情后,B超声波连续监测并适时采集第一卵泡波出现偏差前的最大卵泡(the largest follicle at predeviation,PDF1)和第二大卵泡(the second largest follicle at predeviation,PDF2),构建RNA文库后Illumina平台测序,经数据库比对,设定参数筛选高表达基因、差异表达基因并进行GO分析,Genecards基因功能查询进一步筛选与卵泡发育直接相关的调控基因,q RT-PCR对筛选的基因进行表达量验证分析。【结果】两个转录本中共获得263个差异表达基因;GO功能聚类分析共分为三大类90组:其中生物学过程占64.4%,细胞组分占17.8%,分子功能占17.8%;获得一些重要的功能富集通路,如调控信号转导和细胞因子应答的生物途径;基因表达量分析筛选出10个高表达的上调和下调基因,获得参与雌激素合成和胎儿性别发育的CYP17A1、参与类固醇激素合成的LOC785462、细胞发育过程中调节细胞凋亡的DACH1以及调节ERK和MEK1/2信号通路的MAP3K3。Genecards功能查询共获得6个基因与卵泡发育关系较为密切,其中上调基因分别为PRSS35,PTGRF,ARID4B,GPR116;下调基因为APOA1和CPXM1;q RT-PCR结果显示,PRSS35和ARID4B在DF中的表达量显著高于SF(P0.05),CPXM1在SF中的表达量极显著高于DF(P0.01),PTGRF,GPR116和APOA1在DF和SF中的表达量不存在显著差异(P0.05),但其表达变化趋势与高通量测序结果相一致。【结论】转录组测序结果真实可靠,PRSS35和ARID4B在卵泡发育过程中发挥正调控作用,CPXM1在卵泡发育过程中发挥负调控作用,获得的牛卵泡发育相关基因和重要调节途径,对后期深入探讨卵泡发育调控机理的研究具有重要意义。 相似文献
6.
《中国农业科学》2020,(7)
【目的】研究牛卵泡发育过程中关键调控蛋白CART的候选受体AGTR2的分子特征和立体结构,并结合AGTR2在不同生理状态牛卵泡的表达特性分析其功能。【方法】同期发情处理后,经B超声波连续监测(每12h一次)采集牛双侧卵巢,分离优势卵泡(dominant follicles, DF)和从属卵泡(subordinate follicles, SF);其中3头牛DF和SF分别分离颗粒细胞(granulosa cells, GCs),抽提总RNA后,经反转录、引物特异性扩增、胶回收及测序,获得AGTR2基因全CDS区;生物信息学方法对其序列结构、亲缘关系及立体结构进行分析;设计AGTR2和内参基因RPLP0 qRT-PCR引物,分析AGTR2在牛DF和SF的差异表达情况;另1头牛DF和SF经4%多聚甲醛固定后,设定阳性、阴性对照组和试验组,应用免疫组织化学技术对AGTR2进行表达和定位分析。【结果】AGTR2 CDS区全长1 089 bp,编码362个氨基酸;牛卵泡AGTR2氨基酸序列与NCBI数据库获得的其他24种动物对应的氨基酸序列BLAST分析表明,该序列与印度水牛序列相似性最高(99.4%),与其他动物序列相似性为92.0%—98.9%;立体结构和功能域分析表明,AGTR2立体结构中包含有7个横跨细胞膜的平行的α螺旋结构,符合G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors, GPCRs)的典型特征;qRT-PCR分析结果表明AGTR2 mRNA在DF的表达量极显著高于SF(P0.01),且差异表达倍数达7.47倍;免疫组织化学分析结果表明AGTR2在牛DF和SF颗粒层、膜层细胞均有表达,特异性显色强度表明AGTR2在SF膜层细胞表达量高于DF。【结论】AGTR2属于G蛋白偶联受体,符合神经肽CART受体的基本特征;本试验为进一步研究AGTR2在牛卵泡发育过程中调控信号通路和激素分泌的机理奠定基础,同时,对后期鉴定CART的受体、深入阐明CART调控牛卵泡发育的作用机理具有重要意义。 相似文献
7.
【目的】研究牛卵泡发育过程中关键调控蛋白CART的候选受体AGTR2的分子特征和立体结构,并结合AGTR2在不同生理状态牛卵泡的表达特性分析其功能。【方法】 同期发情处理后,经B超声波连续监测（每12 h 一次）采集牛双侧卵巢,分离优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）;其中3头牛DF和SF分别分离颗粒细胞（granulosa cells, GCs）,抽提总RNA后,经反转录、引物特异性扩增、胶回收及测序,获得AGTR2基因全CDS区;生物信息学方法对其序列结构、亲缘关系及立体结构进行分析;设计AGTR2和内参基因RPLP0 qRT-PCR引物,分析AGTR2在牛DF和SF的差异表达情况;另1头牛DF和SF经4%多聚甲醛固定后,设定阳性、阴性对照组和试验组,应用免疫组织化学技术对AGTR2进行表达和定位分析。【结果】 AGTR2 CDS区全长1 089 bp,编码362个氨基酸;牛卵泡AGTR2氨基酸序列与NCBI数据库获得的其他24种动物对应的氨基酸序列BLAST分析表明,该序列与印度水牛序列相似性最高（99.4%）,与其他动物序列相似性为92.0%—98.9%;立体结构和功能域分析表明,AGTR2立体结构中包含有7个横跨细胞膜的平行的α螺旋结构,符合G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors, GPCRs）的典型特征;qRT-PCR分析结果表明AGTR2 mRNA在DF的表达量极显著高于SF（P<0.01）,且差异表达倍数达7.47倍;免疫组织化学分析结果表明AGTR2在牛DF和SF颗粒层、膜层细胞均有表达,特异性显色强度表明AGTR2在SF膜层细胞表达量高于DF。【结论】 AGTR2属于G蛋白偶联受体,符合神经肽CART受体的基本特征;本试验为进一步研究AGTR2在牛卵泡发育过程中调控信号通路和激素分泌的机理奠定基础,同时,对后期鉴定CART的受体、深入阐明CART调控牛卵泡发育的作用机理具有重要意义。 相似文献
8.
【目的】通过分析成熟卵泡液外泌体（mature follicular fiuid Exosomes, mffEXs）和闭锁卵泡液外泌体（atretic follicular fiuid Exosomes, affEXs）miRNA的表达差异,探索卵泡液外泌体（EXs）miRNA在卵泡发育和闭锁过程中的调控作用。【方法】本研究通过抽提4—6 mm猪成熟发育和闭锁卵泡的卵泡液分离外泌体,进行粒径分析及Western Blot检测对EXs进行鉴定,接下来对特征性EXs携带的miRNA测序和功能富集分析,筛选关键信号通路和差异基因。最后,将mffEXs和affEXs作为添加剂进行颗粒细胞培养,利用Q-PCR检测技术分析关键基因的表达,验证两类卵泡液内EXs miRNA在卵泡发育中的调控功能。【结果】成功分离了mffEXs和affEXs,对比mffEXs测序结果,affEXs中有90个miRNA上调表达,220个miRNA下调表达,表明了卵泡液中的miRNA表达水平与调控卵泡发育有关;KEGG富集分析结果显示两类卵泡的差异信号通路主要集中在Ras、cAMP、P53和MAPK等信号通路,涉及调控卵母细胞发育、减数分裂以及颗粒细胞细胞周期等生物学功能。在闭锁卵泡中,上调表达的ssc-let-7a和ssc-miR-133a-3p分别潜在靶向调控细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK1）和胰岛素生长因子（IGF1）,抑制了G1和G2/M期的运转和类固醇激素代谢,促使颗粒细胞周期运转受阻和颗粒细胞凋亡,引起卵泡闭锁的发生;下调的ssc-miR-21-5p潜在靶向肿瘤抑癌基因（P53）,抑制细胞周期运转,促使颗粒细胞凋亡。在体外培养的颗粒细胞中分别添加mffEXs和affEXs,Q-PCR结果显示CDK1在mffEXs中显著上调表达,而P53显著下调表达,表明了测序分析结果的可靠性。这些结果均显示了affEXs中miRNA表达水平的变化促使颗粒细胞凋亡和细胞周期阻滞,引起卵泡闭锁。【结论】猪affEXs携带miRNA增加了对CDK1、IGF1和P53的表达调控,抑制颗粒细胞细胞周期运转和类固醇激素代谢等信号通路,引起颗粒细胞凋亡,导致卵泡闭锁。 相似文献
9.
《西南农业学报》2019,(12)
【目的】本文对山羊卵泡差异表达的环状RNA circ_ZCCHC24进行了成环鉴定和表达定位分析。【方法】分别采用生物信息学技术、Sanger测序技术、实时荧光定量PCR和荧光原位杂交技术,研究了circ_ZCCHC24的序列和结构组成、接头序列中的环化位点和表达定位情况。【结果】circ_ZCCHC24是由山羊ZCCHC24基因的部分第1内含子和第2外显子环化而成,sanger测序结果也证明了这一结果;circ_ZCCHC24在麻城黑山羊卵泡中的表达量显著高于波尔山羊卵泡(P0.01)。circ_ZCCHC24表达具有组织特异性,在波尔山羊肾脏高表达,卵泡中低表达;circ_ZCCHC24定位于山羊卵泡颗粒细胞的胞质中,发挥"miRNA吸附海绵"的功能。【结论】本研究为进一步研究circ_ZCCHC24调控母羊卵泡发育的分子机理,挖掘出高产母羊的特有调控通路奠定了基础,也为高繁殖力山羊品种的培育提供新靶点。 相似文献
10.
【目的】为发掘和研究红螯螯虾功能基因SSR标记奠定基础。【方法】对红螯螯虾肝脏、精巢以及卵巢转录组测序选用新一代高通量测序技术Illumina Hi Seq 2000,同时借助生物信息学法展开基因表达谱探究及功能基因预测。【结果】肝脏组织获得47 629 414条clean reads,精巢组织获得47 018 968条clean reads,卵巢组织获得53 267 362条clean reads。所有reads组装后获得了67 369个Unigene。通过GO分类,16 989个Unigene被分为3个种类,即生物学过程、细胞组分、分子功能。通过COG分类,4 697个Unigene被分为25个种类。通过KEGG分类,9 842个Unigene分属331个代谢途径。【结论】通过对红螯鳌虾肝脏等3个组织转录组的测序,获得了其相关基因的表达图谱及其功能分类。 相似文献
11.
【目的】分析去乙酰化酶SIRT1基因在猪不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达规律,为进一步了解SIRT1基因在猪卵泡发育中的调控机制奠定基础。【方法】采集猪卵巢,分离卵泡颗粒细胞,根据直径将其分为≤1.5mm,1.5~≤3.0mm,3.0~≤5.0mm,5.0mm 4个组,利用免疫组织化学方法分析SIRT1蛋白在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达定位,利用qRT-PCR和Western blotting方法分析SIRT1基因在不同直径卵泡颗粒细胞中mRNA和蛋白的表达量。【结果】SIRT1蛋白在不同发育卵泡颗粒细胞中均有表达,随着卵泡的发育,SIRT1蛋白表达量逐渐升高,其在原始卵泡中表达量最低,在其余卵泡中表达量较高。SIRT1mRNA及其蛋白在不同直径的卵泡中表达趋势一致,在直径1.5~≤3.0mm卵泡中的表达量极显著高于其他直径卵泡(P0.01)。【结论】SIRT1基因在不同卵泡中的表达具有规律性,与猪卵巢卵泡发育具有潜在的相关性。 相似文献
12.
【背景】卵泡的发育状况和成熟排卵数量是哺乳动物的繁殖力和生产性能的重要决定因素。卵泡闭锁是卵泡停止发育并发生退化的过程,可能发生在卵泡发育的各个阶段,而闭锁的发生与卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡情况密切相关,而颗粒细胞的凋亡过程十分复杂并且受到各种细胞因子的调控作用。环状RNA（circRNA）是近年来在生物体内发现的一种环状结构非编码RNAs（ncRNAs）。研究证明circRNA普遍存在于各个组织且参与到各种生理过程的调节中,但其在家畜繁殖学领域,尤其是猪卵巢和卵泡中的表达变化、位置分布和生物学功能研究较少。抑制素（INH）是一种性腺糖蛋白激素,主要由雌性动物卵巢卵泡的颗粒细胞产生,是控制哺乳动物排卵的重要因子。前期实验发现,猪卵泡中INHβ亚基INHBB编码基因的mRNA的前体可能形成一个circRNA,即circINHBB。【目的】在猪中等有腔卵泡组织中验证circINHBB的序列结构及其在颗粒细胞中的分布情况;分析其在健康、闭锁卵泡中的表达差异;在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中探索了circINHBB对细胞凋亡的调控作用,并对circINHBB可能介导的功能性miRNA做出预测,为家畜繁殖领域的circRNAs研究扩宽思路,为提高家畜繁殖力研究提供参考。【方法】采集中等大小猪卵泡,进行RNA提取及反转录获得猪卵泡的cDNA,利用反向引物进行PCR扩增,PCR扩增产物经Sanger测序证明circINHBB的序列和环状结构;设计circINHBB的特异性荧光探针,运用FISH实验验证circINHBB在猪卵泡颗粒细胞核、质中的分布情况;然后,通过外观、激素和颗粒细胞密度指标选取健康和闭锁两组,用qRT-PCR检测circINHBB在猪健康和闭锁卵泡中的表达差异;最后,设计circINHBB的特异性siRNA（si-circINHBB）,在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中,转染si-circINHBB及其对照,利用流式细胞术检测circINHBB对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控作用,预测circRNA可能参与的miRNA调节。【结果】PCR及Sanger测序验证了circINHBB在猪卵泡中的特异性存在,且证实了circINHBB是由INHBB编码基因的mRNA的前体经反向可变剪切形成的环状结构RNA;FISH实验进一步验证了circINHBB在猪卵泡颗粒细胞的细胞质中分布;qRT-PCR结果证实,与猪健康卵泡相比,circINHBB的表达量在猪闭锁卵泡中显著降低;流式细胞术检测结果表明当敲减circINHBB后,猪卵泡颗粒细胞的凋亡水平显著上升,说明circINHBB对猪卵泡颗粒细胞的凋亡有显著的抑制作用;生物信息学分析表明,circINHBB可能与10个已知miRNA相互作用,通过TGF-β、Notch等信号通路参与调控颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁过程。【结论】在猪卵泡中验证了circINHBB的环状结构及胞质中的特异性表达分布,证实了其在闭锁卵泡中表达量低于健康卵泡,通过体外实验证实了circINHBB是细胞凋亡的抑制因子,可能通过吸附相关miRNA参与调节卵泡的发育和闭锁过程。 相似文献
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中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌早期胁迫的转录组学 总被引：4，自引：3，他引：1
【目的】白垩病是困扰养蜂生产的顽疾。目前,尚无利用二代测序技术研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫白垩病的报道。本研究利用RNA-seq技术对健康(Ac CK)及球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫的中蜂4日龄幼虫肠道(Ac T)进行深度测序,在转录组水平研究中蜂幼虫在球囊菌胁迫早期的胁迫应答。【方法】通过Illumina Hi Seq 2500平台对Ac CK和Ac T进行双端(PE125)测序,首先对测序数据进行质控和评估,利用edge R软件进行差异表达基因(DEG)分析,进而对DEGs进行GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析,最后,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Ac CK和Ac T的转录组测序共得到188 457 338条原始读段(raw reads),经过滤得到182 088 448条有效读段(clean reads),两端Q20与Q30均在97.96%和94.97%以上,说明测序数据质量良好;主成分分析(PCA)结果显示第一与第二主成分可分别解释基因表达总体差异的75.8%和10.7%;DEG分析结果显示上调基因与下调基因的数量分别为344和239个;GO富集分析结果显示DEGs共富集在36个GO分类(term)上,其中基因富集数最多的细胞(106 unigenes)、细胞组件(106 unigenes)和代谢进程(104 unigenes);KEGG代谢通路富集分析结果显示上调与下调基因分别富集在72个和45个代谢通路上,其中上调基因富集数最多的是核糖体(72 unigenes)、碳代谢(16 unigenes)和糖酵解(14 unigenes),而下调基因富集数最多的是碳代谢(9 unigenes)、二羧酸代谢(8 unigenes)和氨基酸生物合成(7 unigenes),进一步分析表明中蜂幼虫肠道的部分细胞免疫对球囊菌的胁迫产生应答,而体液免疫不产生应答,宿主的代谢相关基因受到球囊菌的显著抑制。【结论】揭示了中蜂幼虫在球囊菌入侵早期的胁迫应答,为深入解析中蜂幼虫的胁迫应答机制提供了重要信息,也为在分子水平研究关键应答基因打下了基础。 相似文献
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《西南农业学报》2018,(11)
【目的】通过small RNA高通量测序技术,筛选绵羔羊和成年母羊差异表达miRNA,进一步挖掘和鉴定与卵泡发育相关的相关基因,揭示其性状差异的信号通路及分子调控网络。【方法】以绵羔羊和成年母羊颗粒细胞为研究对象,应用高通量测序技术进行small RNA文库构建,获得miRNA表达谱,鉴定差异表达miRNA,进而对这些差异表达miRNA及其靶基因进行功能注释、聚类分析及通路富集等。【结果】从2个样本miRNA库鉴定出238个已知miRNAs和79个新miRNAs。共获得9个差异miRNA,与成年羊相比,羔羊有4个miRNA上调,5个下调。其中,oar-miR-106a上调倍数最大(1. 85),oar-miR-10a下调最为显著(-2. 20)。对差异miRNAs进行GO富集和KEGG通路富集分析表明,新陈代谢途径富集的基因最多。利用qRT-PCR对5个随机挑选的miRNA进行验证,结果与测序数据一致,说明测序结果可靠。【结论】miRNAs可能在激素处理后对绵羊生殖生理中起着重要的作用,包括卵泡和卵母细胞的发育,颗粒细胞的增殖等。 相似文献
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[目的]本文旨在通过对猪卵泡颗粒细胞进行转录组测序了解卵泡闭锁相关基因的表达谱并确定闭锁卵泡的潜在分子标记物。[方法]通过HE染色对卵泡及颗粒细胞进行形态学观察；抽取健康卵泡和晚期闭锁卵泡的颗粒细胞，进行转录组测序分析，最后采用实时荧光定量PCR检测差异表达基因的相对表达水平。[结果]转录组数据表明，与闭锁卵泡颗粒细胞相比，健康卵泡颗粒细胞中有771个差异基因，其中204个为上调基因，567个为下调基因；GO功能富集分析显示，差异基因显著富集到320个生物进程中，主要与细胞增殖和血管生成有关；KEGG通路分析表明，差异基因富集到48条信号通路中，主要参与氧化应激、激素合成和能量代谢等方面的信号通路；实时荧光定量PCR结果表明，CYP1B1、PDE10A、NUPR1、NOX4、LDLR、LHCGR和CYP19A1表达趋势与测序结果一致。[结论]氧化应激、血管生成、能量代谢以及激素合成等多方面因素综合调控猪卵巢中颗粒细胞的凋亡，继而影响卵泡闭锁现象的产生。 相似文献
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为了从单卵泡水平建立非闭锁大小卵泡颗粒细胞基因表达的消减文库,选择繁殖性能正常、空怀高繁殖力黄淮山羊2只,以氯前列烯醇处理40h后取卵巢,计数卵泡并测量卵泡直径,钝性分离采集卵泡颗粒细胞,置于液氮内保存,取样后的卵泡部分组织采用原位缺口末端标记法(TUNEL)进行闭锁鉴定。选择直径6和4mm非闭锁卵泡,提取颗粒细胞mRNA,扩增cDNA,监测抑制消减杂交及其文库构建的试验环节。结果表明:消减文库的阳性克隆测序成功率100%,从正向文库中随机挑取96个克隆进行差异表达的筛选,发现12个全新表达序列标签;应用RT-PCR对已知序列的抑制素βA亚基基因(INHBA)和谷胱甘肽S-转移酶A1基因(GSTA1)进行表达水平测定,证实了颗粒细胞2个基因mRNA的表达模式与差异显示的结果相同。表明消减文库构建成功。 相似文献
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SIRT1是一种二氢尿嘧啶脱氢酶(NAD)依赖的具有去乙酰化酶活性的多功能转录调节因子.本研究分析不同闭锁阶段卵泡颗粒细胞中SIRT1基因表达规律性,探讨SIRT1基因表达量与卵泡发育的关系.采用免疫组织化学方法分析SIRT1蛋白表达定位,qRT-PCR方法分析SIRT1 mRNA表达量.结果表明,SIRT1蛋白在晚期闭锁卵泡中最高,健康卵泡中最低,SIRT1 mRNA表达规律性与SIRT1蛋白表达规律性一致.综合分析,颗粒细胞中SIRT1基因随着卵泡的闭锁表达量逐渐升高,SIRT1表达与猪卵巢卵泡发育存在一定相关性. 相似文献
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【目的】比较山羊Capra hircus卵巢基质、大卵泡和小卵泡间的m RNA表达图谱,为探究卵泡发育机制提供一定的研究基础。【方法】采用高通量测序技术对发情期川中黑山羊的卵巢基质、大卵泡和小卵泡进行转录组测序,利用生物信息学方法检测mRNA表达谱,筛选差异基因,对其进行GO和KEGG通路分析,最后随机抽取5个差异基因进行荧光定量PCR验证。【结果】卵巢基质vs大卵泡、卵巢基质vs小卵泡和小卵泡vs大卵泡的差异表达基因分别为524、180和403个。筛选出INHA、TNFRSF19等15个与卵泡发育相关的基因,其主要富集在内质网蛋白质加工、类固醇生物合成、卵母细胞减数分裂等信号通路。通过q RT-PCR验证,定量结果与测序结果基本一致。【结论】川中黑山羊卵巢基质、大卵泡和小卵泡的基因表达模式不同,小卵泡与卵巢基质的基因表达模式更相近。 相似文献
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【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。 【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。 相似文献
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山羊早期胎儿组织TET1与Wnt通路基因的表达变化及其相关性 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】通过检测TET1和Wnt信号通路相关基因以及DKK家族基因在山羊胎儿发育早期的表达变化,分析TET1与Wnt通路基因的相关性,为TET1调控山羊胎儿发育研究提供理论依据。【方法】选取12只健康大足黑山羊母羊,自然发情后与同一只种公羊自然交配。采用剖腹产手术的方法,分别获得妊娠20、25、30、60和90d的胎儿,对胎儿的生长指标(体重、体长)进行统计,并采集了60和90d胎儿的组织器官样品(心、肝、肺、肾、脑、皮肤),通过Real-time PCR(RT-PCR)检测各样品中TET1基因,DKK家族基因(DKK1、DKK2、DKK3)和Wnt家族基因(Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b、Wnt16)的相对表达量。利用SPSS软件分析山羊胎儿发育早期不同阶段TET1与WNT信号通路相关基因相关性以及基因表达显著性(P0.05)。【结果】山羊妊娠早期胎儿生长在60d后有显著变化。荧光定量检测结果表明,TET1基因表达随妊娠天数的增加呈上升趋势。Wnt家族基因在山羊胎儿发育中都检测到表达(Wnt2,-2b,-4,-5a,-5b,-7b,-16)。其中,Wnt2和Wnt7b表达量随胎儿发育逐渐增高;Wnt2b、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b在妊娠30 d时有显著高表达(P0.05);Wnt4在胎儿发育20 d时表达显著(P0.05);Wnt16基因在妊娠25 d有显著高表达(P0.05)。DKK家族基因表达检测结果显示,DKK1在胎儿发育早期阶段都有表达,DKK2/3在妊娠初期表达量较低,后期表达增高。通过组织中基因表达检测显示,TET1在90d胎儿肝、肺、肾和脑中的表达水平相比于60d胎儿组织升高,肝中表达量显著(P0.05)。Wnt家族基因Wnt2在组织器官中有相对活跃的表达,妊娠90d胎儿肺中表达量极显著(P0.01);Wnt16基因在胎儿皮肤组织中表达显著(P0.05),且维持在一个较高的水平;Wnt5a和Wnt7b在肾中表达显著(P0.05),其他Wnt基因在组织中都有表达。相关性分析显示,胎儿生长指标(体重、体长)变化与TET1的表达呈极显著正相关(P0.01);TET1在胎儿发育早期的表达与Wnt2、Wnt7b、Wnt16呈现正相关,与Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b呈负相关,其中与Wnt5b呈显著负相关(P0.05),与Wnt7b呈极显著正相关(P0.01)。Wnt通路基因之间也有相互关系,Wnt2与Wnt4呈极显著负相关(P0.01)。Wnt2与Wnt7b,Wnt2b与Wnt5a、Wnt5b,Wnt5a与Wnt5b呈极显著正相关(P0.01)。Wnt4与Wnt5a呈显著正相关(P0.05)。【结论】获得了TET1与Wnt基因在山羊胎儿发育早期的表达模式,并进行了相关性分析,填补了这些基因在山羊方面的研究空白;TET1与Wnt基因对山羊胎儿早期的发育和组织的形成是一个动态的调控变化过程;TET1基因表达与部分Wnt基因呈现显著正相关,部分呈现显著负相关;Wnt通路基因之间表达量呈现一定的相关性。这些数据为TET1与Wnt分子调控山羊早期胎儿发育的机制深入研究提供了参考。 相似文献