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1.
为了研究驱动蛋白Kif5B对乙型脑炎病毒(JEV)复制的影响,根据GenBank数据库中猪Kif5B基因的mRNA序列,采用RT-PCR扩增Kif5B基因片段并连接到pCAGGS-Flag载体中,经双酶切鉴定结合基因测序结果,成功构建真核表达重组载体pFlag-Kif5B。间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白印迹试验(Western blot)结果证实,pFlag-Kif5B在猪肾细胞-15(PK-15)和猪肺泡巨噬细胞3D4/21中成功表达。JEV感染成功转染pFlag-Kif5B的2种细胞后,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、Western blot和IFA证实Kif5B能够明显促进JEV的复制。结果表明：Kif5B真核表达质粒构建成功,且过表达的Kif5B蛋白显著促进JEV在PK-15和3D4/21细胞中的复制,为深入研究Kif5B蛋白促进JEV感染的分子机制提供了理论依据。 相似文献
2.
O型口蹄疫病毒样颗粒编码基因的真核表达载体构建及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为了构建O型口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒编码基因的真核表达载体,将FMDV结构蛋白VP0、VP1、VP3的基因分别克隆到真核表达载体pVAX1中,再分别通过带有BsmBⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,分别对重组质粒pVAX-VP0、pVAX-VP1和pVAX-VP3扩增后进行酶切,用T4连接酶连接得到重组的真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3。对重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3进行PCR鉴定并测序。用脂质体将重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3转染BHK-21细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)及Western blot检测重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3在细胞中的表达情况。结果表明,成功构建了重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3,并在BHK-21细胞中得到表达。 相似文献
3.
试验旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV） p54蛋白的重组伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）。通过无缝克隆构建含有PRV TK基因同源臂和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的PRV通用转移载体pCAGIG-TK（l+r）,参考China/2018/AnhuiXCGQ株基因序列,优化合成E183L基因,并连入通用转移载体,构建重组中间转移质粒pCAGIG-TK（l+r）-p54;重组质粒ScaⅠ酶切线性化后经脂质体介导转染BHK-21细胞,6 h后感染0.1个感染复数（MOI） PRV变异株,出现病变后通过空斑挑选和PCR鉴定纯化重组PRV,进一步通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测外源蛋白表达,并对重组病毒的遗传稳定性和增殖特性进行研究。结果显示,转染重组质粒pCAGIG-TK（l+r）-p54的BHK-21细胞24 h后可观察到绿色荧光,说明重组质粒成功转入BHK-21细胞;纯化后的重组病毒表达绿色荧光蛋白且含有ASFV E183L基因,Western blotting和IFA结果证实重组PRV在BHK-21细胞中能表达p54外源蛋白,在26 ku处呈现特异性条带,且能与ASFV阳性血清发生特异性反应,免疫原性较好;重组病毒在BHK-21细胞上连续传代20次均能检测到ASFV E183L基因,遗传稳定性较好;一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性差异不大,且二者的最高病毒滴度分别为107.34/0.1 mL和107.61/0.1 mL,外源片段的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖能力。本研究成功获得了表达ASFV p54蛋白的重组病毒rPRV-p54,为进一步研究p54蛋白的免疫原性及开发非洲猪瘟多基因重组PRV载体疫苗奠定了基础。 相似文献
4.
CBL蛋白是一种E3泛素连接酶,在免疫调控、信号传导调节和对多种刺激的反应中起重要作用。本研究的主要目的是探讨真核表达的CBL蛋白对H9N2禽流感病毒增殖及感染细胞的凋亡情况的影响。荧光显微镜下观察真核表达重组载体EGFP-CBL在MDCK细胞内正常表达,qPCR结果证实禽流感病毒H9N2亚型感染的转染EGFP-CBL重组载体的MDCK细胞内病毒滴度明显少;Western blot结果证实禽流感病毒H9N2亚型感染的转染EGFP-CBL重组载体的MDCK细胞36 h,其凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值较大;流式分析结果显示转染EGFP-CBL重组载体的MDCK的早期凋亡细胞的比例少,暗示CBL蛋白能够一定程度上抑制MDCK细胞的凋亡。该结果表明CBL蛋白能在一定程度上抑制H9N2禽流感病毒在MDCK细胞的扩增,并且抑制细胞的凋亡,为深入研究CBL蛋白抗病毒细胞机制提供了重要的试验依据。 相似文献
5.
将重组质粒pGEM-T-SOD中的副结核分枝杆菌SOD基因亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建真核表达重组质粒pVAX1-SOD,以脂质体介导法转染至BHK-21细胞中,并采用RT-PCR和间接免疫荧光技术检测SOD基因在BHK-21细胞中的表达。结果显示,成功地构建了副结核分枝杆菌SOD基因的真核表达载体,且SOD基因在哺乳动物细胞中获得了表达。为研究副结核分枝杆菌SOD基因的免疫效果及作为牛副结核病DNA疫苗奠定基础。 相似文献
6.
《畜牧兽医学报》2017,(4)
旨在构建稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞株,对NYD-SP27基因的表达特征进行分析,为进一步研究NYD-SP27基因功能奠定基础。本研究克隆绵羊NYD-SP27基因,并将其插入到真核表达载体pDsRed1-C1中,利用猪捷申病毒2A肽(P2A)将NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白连接以实现共表达,将重组质粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP转染至BHK-21细胞中,经G418筛选获得稳定转基因细胞株,利用RT-PCR、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blot对NYD-SP27基因的表达进行鉴定。结果表明,NYD-SP27基因稳定整合至宿主细胞基因组;NYD-SP27蛋白能够在BHK-21细胞中正常表达,分子大小约为63ku;在NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白翻译过程中,P2A成功自我剪切。本研究成功构建了绵羊NYD-SP27基因的真核表达载体,建立了稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞系。 相似文献
7.
为研究Asia 1型口蹄疫病毒（FMDV）前导蛋白（Lpro）亚细胞定位,利用RT-PCR方法获得L基因,将其定向克隆入pEGFP-N1真核表达载体,经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pEGFP-L。利用脂质体介导法将pEGFP-L转染BHK-21细胞,用荧光显微镜观察和Western blotting方法检测目的基因的表达,经碘化丙啶（PI）染色后在激光共聚焦显微镜下观察Lpro的亚细胞定位。结果表明,成功构建重组表达质粒pEGFP-L;FMDV L基因在BHK-21细胞中得到表达;Western blotting证实表达的Lpro具有反应活性;激光共聚焦显微镜观察发现Lpro在BHK-21细胞中呈弥散性分布。 相似文献
8.
猪日本乙型脑炎病毒(JEV)是引起以母猪流产为主要特征的繁殖障碍性疾病病原之一,笔者拟构建JEV的DNA型复制子载体,并利用该载体表达外源基因。以JEV毒株SA14-14-2为基础,去除病毒结构蛋白基因prM和部分E基因而保留全部非结构蛋白和非编码区序列,插入FMDV2A和丁肝病毒核酶序列构建复制子表达载体pAC-JEV,实时定量PCR、间接免疫荧光、Western blotting方法检测JEV自身蛋白(NS3)表达,验证复制子的自主复制能力。在pAC-JEV的结构蛋白C基因下游插入EGFP基因、猪流感病毒的HA和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的GP5基因构建重组复制子pAC-JEV-EGFP、pAC-JEV-HA、pAC-JEV-GP5和NS5基因缺失载体pAC-JEV-ΔNS5,该复制子载体转染BHK-21,荧光显微镜直接观察EGFP表达,Western blotting方法检测外源蛋白质(GFP、GP5、HA)表达情况。结果表明:随着转染时间延长,复制子转染细胞内NS3的表达逐渐增加,表明所构建的JEV复制子表达载体具有自主复制能力。EGFP mRNA转录水平和EGFP蛋白质荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续8d以上,携带猪流感病毒的HA和猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5基因的复制子载体转染BHK-21细胞后,HA和GP5能有效表达,说明复制子具有表达外源蛋白质的能力。该复制子表达载体的成功构建,为深入研究JEV各蛋白质的功能、各蛋白质与细胞内蛋白质相互作用关系以及基于复制子载体的疫苗开发等提供了技术平台。 相似文献
9.
为研究Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)前导蛋白(Lpro)亚细胞定位,利用RT-PCR方法获得L基因,将其定向克隆入pEGFP-N1真核表达载体,经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pEGFP-L.利用脂质体介导法将pEGFP-L转染BHK-21细胞,用荧光显微镜观察和Western blotting.方法检测目的基因的表达,经碘化丙啶(PI)染色后在激光共聚焦显微镜下观察Lpro的亚细胞定位.结果表明,成功构建重组表达质粒pEGFP-L;FMDVL基因在BHK-21细胞中得到表达;western blotting证实表达的Lpro具有反应活性;激光共聚焦显微镜观察发现Lpro在BHK-21细胞中呈弥散性分布. 相似文献
10.
为了构建表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒,本研究通过基因重组的方法将辛德毕斯病毒E基因及绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因分别连接至痘苗病毒转移载体pSTK,酶切鉴定得到阳性重组质粒pSTK-SINE-EGFP。采用脂质体转染的方法,将该重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染BHK-21细胞,通过同源重组获得重组痘苗病毒。利用EGFP筛选阳性重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP,收集感染重组痘苗病毒的BHK-21细胞,SDS-PAGE电泳检测辛德毕斯病毒E基因在细胞中的表达情况,Western blot分析表达产物的免疫原性。结果证明辛德毕斯病毒E基因能在重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP中获得表达,且表达产物具有良好的免疫原性。表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒的成功构建,为研制辛德毕斯病毒活载体疫苗奠定了基础。 相似文献