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1.
根据鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DFV) NS5基因序列特征设计引物,建立基于SYBR Green Ⅰ检测模式的实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR,RRT-PCR),该方法检测DFV NS5基因2.74×103～2.74×10 7拷贝/μL反应范围内有很好的线性关系.扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(86.23±0.18)℃,对禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭源禽1型副黏病毒、鸭减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.52％～1.48％,组间变异系数0.71％～2.21％.检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4h. 相似文献
2.
《中国动物传染病学报》2020,(4)
本研究以新型鸭细小病毒VP3基因保守区域克隆至pMD19-T载体上获得的阳性质粒作为标准阳性质粒,建立一种检测新型鸭细小病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示:在5.17×10~1～5.17×10~7拷贝数呈良好的线性关系,相关系数R~2为0.999、斜率为3.595,灵敏度可达到5.17拷贝数;该方法用于检测鸭常见传染病呼肠孤(DRV)、禽流感(AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭病毒性肝炎(DHV)、鸭星状病毒(DAstV)无非特异性扩增,特异性良好;对安徽、山东、江苏等地鸭场采集的疑似病料进行初步检测,发现48份样品中阳性率达70.8%,与普通PCR方法检测结果相比,本研究建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法更灵敏。本研究成功建立了一种检测新型鸭细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量方法,为新型鸭细小病毒的监测奠定了坚实基础。 相似文献
3.
4.
为建立鸭巴泰病毒(Batai virus,BATV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,研究根据鸭BATV非结构蛋白(NSs)基因特征,设计引物,经条件优化后建立检测BATV感染的qRT-PCR方法。用建立的qRT-PCR方法对临床72份疑似BATV感染的病料进行检测,并对阳性样品进行病毒分离,评价两种方法的符合率。结果表明,当病毒NS基因含量为3.59×10~2~3.59×10~7拷贝/μL时有良好的线性扩增,其扩增相关系数为0.9994,扩增效率为98%。最低检测限为3.59×10~2拷贝/μL;扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(81.60±0.16)℃,对鸭源常见病毒(如鸭甲肝病毒、禽坦布苏病毒、禽Ⅰ型副黏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、新型鸭呼肠孤病毒和番鸭呼肠孤病毒)检测均为阴性,组内变异系数和组间变异系数分别为0.49%~1.99%和0.58%~2.18%。临床送检的72份病料SYBRⅠ实时荧光定量PCR方法的阳性率为4.17%(3/72),并分离到2株鸭源BATV,2种方法的阳性符合率为66.67%(2/3)。建立的基于SYBRⅠ检测BATV的qRT-PCR方法、特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于BATV的分子流行病学研究。 相似文献
5.
《中国家禽》2021,(8)
为建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的鸭坦布苏病毒(DTMUV)数字RT-PCR定量检测方法,采用鸭坦布苏病毒E基因为靶基因,在前期实时荧光定量RT-PCR方法的基础上,建立了可对其准确定量的微滴式数字RT-PCR方法。通过对反应体系中引物、探针浓度以及反应条件中反转录温度、时间、退火温度进行优化,确定最佳引物浓度为700 nmol/L,最佳探针浓度为350 nmol/L。该方法线性关系良好,在模板浓度为10~0～10~4拷贝/μL范围内其有良好的线性关系(R~2=0.993 4);最低检测限为6.4拷贝/反应,比相同引物探针建立的实时荧光定量RT-PCR方法敏感一个数量级;同时,与其他禽源病毒无交叉反应,且重复性良好,对于10~3数量级的模板进行重复性检测,变异系数仅1.22%。通过对临床样品进行检测,结果显示该方法与实时荧光定量RT-PCR结果一致,表明该微滴式数字RT-PCR方法特异性强、敏感性高,可用于鸭坦布苏病毒的定量检测。 相似文献
6.
《黑龙江畜牧兽医》2014,(23)
为了研究一种可同时检测鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒的二重PCR方法,试验采用DNASTAR及Primer Premier 5.0软件,针对Gen Bank中坦布苏病毒(DTMUV)E基因和鸭圆环病毒(Du CV)REP基因的保守序列,设计合成了2对引物,通过优化反应体系条件及特异性、敏感性评价,建立了鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的二重RT-PCR方法。结果表明:该方法对鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性达到100 fg;使用该方法对新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果全为阴性。说明建立的二重RT-PCR检测方法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒感染的快速鉴别诊断。 相似文献
7.
应用套式RT-PCR快速检测鸭坦布苏病毒 总被引：4，自引：0，他引：4
鸭坦布苏病毒是新发现的一种可引起鸭产蛋下降、生长迟缓和死亡的黄病毒。目前尚无可靠的快速诊断方法用于该病毒的检测。本研究根据鸭坦布苏病毒E基因序列,设计了2对重叠引物P1、P2和P3、P4,建立了检测鸭坦布苏病毒的套式RT-PCR方法,该套式RT-PCR比一般PCR敏感性高10倍。采用该方法对安徽省、河北省、山东省、浙江省、上海市等地发病鸭场的63份样品进行了检测,阳性检出率为48/63（76.2%）,而病毒分离率仅为13/63（20.6%）。由此表明,与其他方法相比较,本试验所建立的套式RT-PCR方法具有快速、敏感、特异优点,可用于鸭坦布苏病毒的流行病学调查及病毒的检测。 相似文献
8.
利用二代高通量测序技术建立检测鸭源样品中坦布苏病毒的方法。首先将样品过滤和经核酸酶处理,再利用等温链位移扩增(SPIA)技术快速制备样品总cDNA,最后经磁珠纯化和文库构建后,通过Ion Torrent进行高通量测序获得基因组信息。结果显示,通过SPIA扩增和核酸文库制备的优化,可从微量病原样本中获得327pmol/μL的核酸文库样本。Ion Torrent测序共获得1 725 436条reads,约6.2M数据,平均109bp。数据拼接并Blast发现,病原样品的核酸序列可注释鸭坦布苏病毒全部基因组数据,与首次发生在我国的鸭坦布苏病毒BYD-1株参考序列的同源性为100%。将所测病毒序列与其他5种黄病毒科成员进行同源性比对,发现与近3年发生在我国的鸭坦布苏病毒同源性最高,在98%以上。且NS基因进化树分析与鸭坦布苏病毒处于同一分支上,符合鸭坦布苏病毒特征。本研究建立的基于未知病原SPIA扩增结合高通量测序检测方法,可同步获知坦布苏病毒基因的核酸信息。 相似文献
9.
《中国家禽》2017,(20)
研究旨在建立一种适用于鸭坦布苏病毒检测的荧光定量Taq Man RT-PCR技术。以JXSP株RNA为模板,建立检测鸭坦布苏病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。制备含有上述目的片段的RNA作为标准品,10倍比稀释后建立标准曲线,测定敏感性。同时采用标准品对该方法的批内和批间重复性进行检测,并与本实验室所保存的多种病毒进行特异性检测。结果:建立的荧光定量Taq Man RT-PCR方法能在鸭坦布苏病毒JXSP株RNA样本中检出荧光信号。最低检出量为2.06×10~1拷贝/反应;线性范围达9个数量级。该方法重复性良好,批内变异系数不足0.4%;批间变异系数不足2.2%。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,经体外感染细胞培养物及临床样品检测证实,该方法可实时反映病毒液中的病毒含量,可在获得样品后3 h以内得到检测结果,可用于临床样品中鸭坦布苏病毒的快速检测。 相似文献
10.
为了检测鸭群中鸭坦布苏病毒的血清学流行情况,本研究在前期成功表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的基础上,建立了检测鸭血清中鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。棋盘法确定了当纯化的NS1蛋白包被量为0.188μg/孔,待检血清1:200稀释,HRP标记的兔抗鸭二抗1:16000倍稀释时反应条件最佳。在最佳反应条件下,阴阳性临界值判定标准为0.467。用建立的间接ELISA方法对番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭肝炎病毒、鸭疫里默氏杆菌阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为6%和10%,显示该方法具有很好的稳定性。用建立的ELISA方法检测临床鸭坦布苏病毒感染鸭及攻毒蛋鸭的55份临床血清样品,测得52份为阳性,阳性率为94.5%,对36份阴性鸭群血清样品进行检测,36份为阴性,阴性率为100%。该方法为鸭坦布苏病毒的诊断和流行病学监测奠定了基础。 相似文献
11.
参考Gen Bank上已发表的鸭坦布苏病毒(DTMUV)NS5基因序列和产蛋下降综合征病毒(EDSV)五邻体(penton)基因序列,分别设计了检测DTMUV和EDSV的特异性引物,扩增目的片段大小分别为242 bp和181 bp。通过退火温度及引物浓度的优化,建立了针对这两种病毒的二重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法可以同时检测DTMUV和EDSV,且不与鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、番鸭呼肠孤病毒、小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒以及大肠杆菌的核酸发生交叉反应;敏感性试验表明,该方法对DTMUV的最低检出限为590个拷贝,对EDSV的最低检出限为3 260个拷贝;该方法重复性良好,对不同批次的样品扩增效果良好。通过检测两种病毒感染的阳性病料各10份,结果显示,该二重PCR检测方法对阳性样品的检出率可达100%。这表明该方法可以用于鸭坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒的检测。 相似文献
12.
为实现鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus,DTMUV）的快速检测,本研究根据GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因的高度保守序列设计了1套引物,通过优化反应体系各组分的浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。结果显示,在最佳条件下甜菜碱对反应体系影响不明显;该方法灵敏度是常规RT-PCR的100倍;只能特异性扩增坦布苏病毒,对于其他常见的禽源病毒无特异性扩增;检测结果可直接通过肉眼观察来判断;对临床74份疑似病料,可检出65份。本试验建立的方法灵敏性高、特异性强,可用于鸭坦布苏病毒病的临床诊断和流行病学调查。 相似文献
13.
《中国动物传染病学报》2016,(1)
该研究旨在建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)的荧光定量PCR诊断方法。本实验以感染新型鸭呼肠孤病毒的鸭组织RNA提取物为模板,根据Gen Bank数据库中呼肠孤病毒S1基因全序列,设计合成了一对特异性引物,PCR扩增基因片段,将其克隆至p ET-30a载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立SYBR Green II荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测。经测序证实扩增片段与预期目的片段相符,所建立的SYBR Green II荧光定量PCR检测S1的反应在101~108 copies/u L之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10 copies/μL,而H5型禽流感病毒、H9型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、C型鸭肝炎病毒、新城疫病毒、鹅细小病毒、鸭瘟病毒等病毒的检测为阴性,表明该方法敏感、特异。本研究成功建立了SYBR Green II荧光定量PCR检测新型鸭呼肠孤病毒的方法,为新型鸭呼肠孤病毒致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台。 相似文献
14.
猪细小病毒7型(PPV7)是近年来新发现的一种新型PPV。目前,缺乏更为高效的针对PPV7的检测方法,为了建立能够快速检测PPV7的方法,本研究根据PPV7 NS1基因的保守区序列,设计1对特异性引物及TaqMan探针。经过各反应条件的优化,初步建立了一种便捷、灵敏、能够快速准确检测PPV7的荧光定量PCR(qPCR)方法,并对其特异性、敏感性、稳定性以及与SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的符合率进行检测与对比。结果显示,该方法除对PPV7的基因组DNA有特异性扩增,对猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及PPV1核酸均无交叉反应,特异性较强。该方法对重组质粒标准品检测限为1.76拷贝/μL,而常规PCR方法检测限为1.76×102拷贝/μL,表明本研究建立的方法敏感性较高。该方法对不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验变异系数均小于1.7%,重复性较好。利用本研究建立的qPCR方法和SYBR Green Ⅰ qPCR方法对采自福建地区的150份样品进行检测,结果显示,两种检... 相似文献
15.
《养殖与饲料．饲料世界》2021,(9)
本研究采集疑似感染鸭坦布苏病毒的蛋鸭卵巢病变组织,经RT-PCR鉴定其结果为鸭坦布苏病毒阳性。将组织处理液接种到SPF鸡胚并盲传3代后成功分离到1株鸭坦布苏病毒,连续传代10代后,病毒含量达到10~(5.0)ELD_(50)/m L。为建立鸭坦布苏病毒病的发病模型,将分离到的鸭坦布苏病毒腿部肌肉接种蛋鸭,每日对鸭只采血并对分离的血清进行病毒分离,摸索鸭坦布苏病毒病的病毒血症规律;另外每日随机挑选10只感染鸭进行剖杀,观察卵泡病变情况,摸索卵泡病变规律。结果显示,感染鸭只第1～3日血清中病毒分离率均为100%,第4日病毒血症阳性率开始下降,第6日病毒血症消失;感染鸭只卵泡第3日开始出现变形、破裂或出血等病理变化,第8～10日病变率达到100%。本研究建立了一种鸭坦布苏病毒感染产蛋鸭的发病模型并确定了发病评判标准,为鸭坦布苏疫苗的免疫效果评价提供了基础。 相似文献
16.
《蚕业科学》2020,(2)
根据桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)cp基因的核苷酸序列,设计了3对用于实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的引物,以含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,通过PCR和熔解曲线分析筛选出1对适合用于qPCR的特异性引物。以10倍梯度稀释的含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,进行SYBR GreenⅠqPCR并制作标准曲线,建立了MCLV的qPCR检测方法。该方法对MCLV cp基因的检测灵敏度≥47.8个拷贝/μL。利用建立的qPCR方法对大田样品进行检测,结果显示15个样品都为MCLV感染阳性,其中病毒含量最高的样品的病毒拷贝数为5.26×10~4个拷贝/μL,最低的样品为8.36×10~2个拷贝/μL。MCLV qPCR检测体系的建立可以为培育健康桑树种苗、预防病毒病的发生提供精准保障技术,也为研究桑树不同生长时期或不同组织中病毒滴度变化奠定了基础。 相似文献
17.
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为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光定量检测方法，本研究根据IBRV gE基因的序列设计了相应的探针和引物，分别建立TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，并对2种方法进行了综合比较。结果显示，TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ定量荧光PCR方法的灵敏度分别达到1.0×101 copies/μL和1.0×102 copies/μL;2种荧光定量方法对除IBRV的其他牛病毒和细菌检测结果均为阴性；重复性检测中变异系数均小于2.3%;检测了130份来自西藏的牦牛样品，2种荧光定量PCR阳性检出率均为100%。以上结果表明，2种荧光定量方法都可用于检测IBRV,且TaqMan-MGB荧光定量PCR敏感性高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。 相似文献
19.
《中国预防兽医学报》2017,(6)
为建立犬细环病毒(TTCV)的快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的TTCV ORF7基因设计合成一对特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了检测TTCV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。结果显示:建立的荧光定量PCR方法 Ct值与标准品模板在5.82×10~9拷贝/μL~5.82×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该检测方法仅对TTCV检测为阳性,而对狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒和犬副流感病毒均无特异扩增;该检测方法灵敏度可达5.82×103拷贝/μL。对27份犬血清样品检测结果显示,建立的荧光定量PCR阳性检测率为11.11%,而普通PCR方法检测阳性率为3.7%。本实验建立了TTCV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,对TTCV诊断及致病机制的研究提供了高通量的定量检测方法。 相似文献