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草鱼出血病病毒减毒的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
草鱼出血病病毒ＧＣＨＶ－８２９野毒株在ＰＳＦ细胞连续传代过程,于培养液中加入一定浓度的桉液,传至１９代已达减毒目的,继续传至２９代其减毒效果保持稳定,２７代后不再加入桉液,继续传至３７代其减毒效果仍然保持稳定不变。致弱病毒对草鱼的安全性好,免疫原性强,用该弱毒株制备的弱毒疫苗免疫草鱼后,草鱼的成活率和免疫保护率均达１００％,表明桉液的草鱼出血病病毒的一种良好减毒剂,经桉液减毒的ＧＣＨＡＶ－８９２是 相似文献
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草鱼出血病病毒ＧＣＨＶ－８２９野毒株在ＰＳＦ细胞连续传代过程,于培养液中加入一定浓度的桉液,传至１９代已达减毒目的,继续传至２９代其减毒效果保持稳定,２７代后不再加入桉液,继续传至３７代其减毒效果仍然保持稳定不变。致弱病毒对草鱼的安全性好,免疫原性强,用该弱毒株制备的弱毒疫苗免疫草鱼后,草鱼的成活率和免疫保护率均达１００％,表明桉液的草鱼出血病病毒的一种良好减毒剂,经桉液减毒的ＧＣＨＡＶ－８９２是 相似文献
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[目的]研究中草药红茶菌的细胞、乳鼠毒性以及对口蹄疫病毒在体外的抗病毒活性。[方法]将中草药红茶菌过滤,用细胞培养液稀释,分别接种在BHK21细胞上观察细胞生长情况,评价其对细胞的毒性作用。将中草药红茶菌用灭菌水稀释,分别接种3日龄乳鼠,观察乳鼠生长、健康状态和接种部位变化情况,评价其对乳鼠的毒性作用。用稀释的中草药红茶菌与浓度为1000LD_50的口蹄疫病毒等量混合,37℃条件下作用30min,接种3日龄乳鼠,观察乳鼠发病死亡情况,估算中草药红茶菌体外可杀灭口蹄疫病毒的最大使用浓度。用稀释的中草药红茶菌与口蹄疫病毒混合,接种BHK21细胞,观察致细胞病变效应,记录不同稀释度的中草药红茶菌对口蹄疫病毒的杀灭效果。[结果]BHK21细胞和乳鼠试验表明,中草药红茶菌在1：4稀释后,对BHK21细胞无毒性反应,并可有效抑制1000TCID_50口蹄疫病毒在BHK21细胞生长繁殖;1：2稀释的红茶菌微生态制剂对3日龄乳鼠无毒性反应,并可有效杀灭1000LD_50口蹄疫病毒。[结论]中草药红茶菌是一种安全性好且对口蹄疫病毒有较好杀灭作用的口蹄疫预防中草药微生态制剂。 相似文献
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狂犬病Flury HEP株的复制及其某些生物学性质的观察 总被引：2，自引：0，他引：2
狂犬病ＦｌｕｒｙＨＥＰ株弱毒在ＢＨＫ（２１）细胞上连续传代，培养物经中和试验、间接荧光抗体染色、电镜观察、动物试验、病毒增殖和抗体消长曲线的测定，证明该弱毒株可在ＢＨＫ（２１）细胞上良好地复制。传至二代以后毒价可达到１０（－５）／０．０３ｍｌ。该毒经兔、犬、山羊、牛试验显示了其安全性。免疫后７天即可见到抗体阳转。免疫犬后，血清中和抗体在二年半时间内维持在一个较高的水平。 相似文献
5.
以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板,用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列,并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析;优化合成059基因编码序列,连接载体pET42a(+),转化Escherichia coli BL21(DE3);用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌,采用免疫印迹检测表达的F1... 相似文献
6.
《农业科学学报》2012,11(12):2035-2042
To develop a modified live vaccine (MLV) against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), virulent CH-1a strain was attenuated by serial passages up to 130 passage (P130) in Marc-145 cells. The virulence and immune efficacy of the attenuated CH-1a were evaluated in pigs. The results showed that animals inoculated with P130 did not develop any clinical sign of the disease, but produced rapid and effective humoral immune responses against PRRSV challenge, indicating that attenuated CH-1a P130 is the candidate as the effective vaccine against PRRSV. To define the potential mutations in the attenuated CH-1a genome, we sequenced and analyzed the ORF5 gene of CH-1a strain of different passages (P39, P55, P65, P70, P85, P100, P115, P120, P125, and P130) and found that three mutations (C5Y, H38Q and L146Q) which may be related with the attenuation of CH-1a. In addition, we also found a unique restriction enzyme site (TspEI) in the ORF5 gene of attenuated CH-1a, which can be used as a genetic marker to distinguish original and attenuated CH-1a. 相似文献
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Adenovirus type 12 transforms the fibroblastic BHK21 (baby hamster kidney) cell line into rounded or cuboidal cells that give rise in hamsters to undifferentiated small cell sarcomas indistinguishable from those induced in newborn hamsters by inoculation of the virus itself. In contrast. cells from this line transformed by polyoma virus retain their fibroblastic morphology and induce fibrosarcomas in hamsters. This suggests that the morphology of tumors induced by the adenovirus-transformed cells from this line may be determined by the viral genome and that such mechanism may also explain the remarkably uniform microscopic appearance which seems to characterize tumors induced in hamsters by direct inoculation of adenovirus type 12. 相似文献
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[目的]利用同源重组技术构建TK基因缺陷的山羊痘病毒（GTPV）毒株,为研制出更安全、高效的GTPV弱毒疫苗和病毒载体提供备选毒株.[方法]采用PCR克隆GTPV AV41株TK基因（ORF56）及其侧翼基因组片段,在TK基因内部插入报告基因EGFP抗性基因gpt达盒,构建GTPV重组转移载体pTK-Eg.将重组转移载体pTK-Eg与GTPV AV41株共转染Vero细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,鉴定其生长特性和遗传稳定性,并接种山羊评价其安全性和免疫原性.[结果]成功构建获得一株TK基因缺陷的重组病毒vTK-Eg.与亲本毒株GTPV AV41相比,vTK-Eg的生长特性及其形成的细胞病变均未发生显著改变,只是毒价略微下降100.5个数量级;在原代牛睾丸（BT）细胞上连续传代,至少在10代内保持遗传性状和病毒滴度稳定.接种vTK-Eg的山羊精神和食欲均正常,接种后体温升高和局部反应的严重程度均较接种亲本毒株GTPV AV41的山羊有所降低;vTK-Eg与GTPV AV41株诱导山羊产生的GTPV中和抗体水平无明显差异（P＞0.05）.[结论]构建的TK基因重组缺陷病毒vTK-Eg具有良好的遗传稳定性和免疫原性,较亲本毒株其安全性也有所提高,可作为研制GTPV基因工程弱毒疫苗和活载体疫苗的备选毒株. 相似文献
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马传染性贫血病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建 总被引：7，自引：1，他引：7
采用PCR方法分 3段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株 (EIAVDLA)的前病毒DNA ,这 3个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组 ,PCR产物经克隆后顺次连接 ,获得 1个含有EIAV全基因 (8.0kb)的重组质粒 ,将其命名为p8.0。将此 8.0kbEIAV全基因再亚克隆到含有一完整EIAVDLA株长末端重复序列的质粒中 ,获得一含有EIAV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒 ,将其命名为p8.2 ,经核苷酸序列分析 ,证明p8.2含有EIAV前病毒的全基因。用p8.2转染驴白细胞 ,将其作为种毒进行传代 ,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶活性 ,说明在驴白细胞中由p8.2衍生出了EIA病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后 ,第 4天出现病变 ,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子 ,进一步证明p8.2具有感染性 ,笔者获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆 ,为进一步在分子水平上阐明我国EIAV疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础 相似文献
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[目的]对一种商业化的低血清培养基适应BHK21细胞进行传代培养,并分析该细胞染色体的变异稳定性,以判定其质量。[方法]采用直接法制备4个代次BHK21细胞的染色体标本,用常规Giemsa染色,在1 000倍光学显微镜下计数中期分裂相染色体数目,并进行核型分析。[结果]BHK21为亚二倍体或亚四倍体细胞系,亚二倍体总数为42,亚四倍体细胞总数为72~74,该细胞系染色体的畸变率在各代次所占比例为0~2%,均较低。[结论]该细胞系的遗传学特性相对稳定,各代次间无本质差异,可候选为制苗用细胞。 相似文献
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采用ＤＮＡ重组技术和蚀斑技术获得融合基因的重组病毒，制备了鸡生长抑制因子（ＳＳ）免疫原，与鸡传染性ＩＢＤ、ＮＤ免疫原共同高免健康产蛋鸡，使其卵黄中产生高效价的抗鸡ＳＳ、ＩＢＤ、ＮＤ抗体，利用含高效价的卵黄制成鸡抗病促生长剂。实验结果表明，该制剂对人工感染的ＩＢＤ鸡治愈率为９７．５％，预防保护率９８．４％；对流行区自然感染的ＩＢＤ鸡治愈率９６％，预防保护率９７％。对健康肉仔鸡应用，可使其育成出栏时间提前３天，每只平均比对照增重１３５．７ｇ；饲料转化率提高８．３７％。 相似文献
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将猪白介素18(Porcine interleukin18,PIL-18)基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建了重组表达质粒pEGFP-PIL-18,利用脂质体法转染BHK细胞,采用荧光显微镜实时观察和RT-PCR检测技术确定目的蛋白的表达情况.结果在转染重组质粒24 h4、8 h后的BHK细胞中均观察到绿色荧光,转染的BHK细胞经G418筛选14 d后,用RT-PCR法检测目的基因,并扩增到长576 bpd的目的cDNA片段。表明在BHK细胞中成功地表达了PIL-18与EGFP的融合蛋白,这为下一步建立稳定表达PIL-18的细胞系奠定了基础. 相似文献
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【目的】 通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法,拯救出毒力减弱的轮状病毒(rotavirus, RV)。 【方法】 以野生型轮状病毒CHLY基因组RNA为模板,通过重叠PCR方法在NSP4基因93-104 nt引入5个沉默突变核苷酸,并将毒力位点区135aa、136aa和138aa对应的核苷酸进行定向突变,构建了含有突变位点的转录质粒△pT7-NSP4/89/M。将该质粒与携带RNA聚合酶基因的重组质粒pcDNA3.1/T7-RNAP共转染已接种野生型RV病毒的MA104细胞单层,继续培养24 h,获得了携带NSP4变异基因的RV病毒粒子和野生型RV病毒粒子的混合病毒。将获得的混合病毒接种MA104细胞,通过RNA干扰和蚀斑克隆方法逐步筛选纯化以获得拯救RV。 【结果】 成功拯救出了NSP4基因变异的RV,该病毒在MA104细胞上的病变和致乳鼠腹泻效果较野生型RV明显减弱。【结论】 通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法成功拯救出毒力减弱的RV;NSP4毒力位点135aa、136aa和138aa的变异对RV毒力改变和腹泻严重程度有影响。 相似文献
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【目的】筛选1株适合PCV2病毒生产的悬浮细胞株,摸索PCV2悬浮生产工艺（病毒种毒来源、MOI及收获时间）,为大规模悬浮培养技术制备疫苗提供试验依据。【方法】使用有限稀释法对PK15原细胞稀释后接种于96孔板,每2 d观察细胞生长和形态,待细胞90%长满后,将细胞从96孔板陆续扩至24孔板、12孔板、6孔板,最后到方瓶,筛选3株可贴壁生长的、形态较好的PK15克隆。3株克隆（PK15-1C8、2F11、1E5）按照1×106细胞/mL的密度,直接接种在PK15的无血清培养基中,并置于37℃,5%二氧化碳,120 r/min的摇床培养箱中继续培养,每天监测细胞密度和活率,每3 d传代,使细胞逐渐适应悬浮环境,驯化为可全悬浮、无血清培养的悬浮细胞株;细胞传代稳定并建库后,接种PCV2病毒,通过对比3株悬浮克隆细胞培养PCV2病毒含量的差异,筛选1株克隆细胞,用于生产PCV2;针对不同种毒（来源于贴壁细胞或悬浮细胞）,摸索感染MOI（0.1、0.2、0.5）及收获时间（48、72、96、120h）,确定PCV2最佳生产工艺。【结果】（1）贴壁细胞置于无血清培养基中,适应至第2代时细胞即可呈悬浮生长,连续传至11代,细胞生长稳定,按照1×106/mL接种细胞,细胞生长72h时细胞密度可达到10×106/mL,活率在95%以上,倍增时间为20h左右;（2）3株悬浮细胞使用相同条件,分别接种PCV2病毒后,PK15-1C8克隆细胞的病毒含量可达到106.4TCID50/mL,克隆PK15-2F11（105.5TCID50/mL）、PK15-1E5（105.6TCID50/mL）,3株克隆细胞病毒含量均高于原克隆（104.7TCID50/mL）,但PK15-1C8克隆细胞的病毒含量更高且更稳定,确定为后续研究用细胞;（3）使用贴壁细胞来源的种毒（106.4TCID50/mL）感染PK15-1C8克隆细胞后,最优工艺为接毒时细胞密度1×106/mL,以0.1MOI接毒,接毒后72h收获,最高病毒含量为106.5TCID50/mL。以来源于悬浮细胞的种毒（106.3TCID50/mL）感染细胞后,病毒含量较贴壁细胞来源种毒更高,最高可达107.3TCID50/mL,其最优工艺为接毒时细胞密度1×106/mL,以0.2MOI接毒,接毒后72h收获。【结论】通过对PK15细胞进行单克隆筛选,驯化悬浮、3株悬浮细胞接种PCV2后病毒含量的对比,确定一株病毒含量最高的悬浮细胞,并以此悬浮细胞为基础进行PCV2生产工艺摸索,建立了全悬浮无血清培养的PK15-1C8细胞增殖PCV2工艺,该工艺首次使用悬浮细胞扩增PCV2病毒为种毒进行接毒,最高病毒含量可达107.3TCID50/mL,可用于工厂化疫苗生产。 相似文献
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本研究将以vvIBDV GX8/99株4株克隆化细胞毒为研究对象,通过鸡胚成纤维细胞连传至20代,得到4株克隆化毒F20代:GX-IBDVE10 C25 CL1-20、GX-IBDVE10 C25 CL2-20、GX-IBDVE10 C25 CL4-20、GX-IBDVE10 C25CL5-20.分别提取RNA,通过Nested-PCR、基因克隆、核苷酸序列测定和分析,从而摸索出了vvIBDV GX8/99株四株克隆株在细胞传代过程中VP2核苷酸序列和推导出的氨基酸序列的变化规律.与原始囊毒和D78疫苗毒相比,4个细胞适应毒克隆株F20 VP2高变区的约145个氨基酸中,有12个位点发生了相同的变异,变得与适应细胞的疫苗毒D78株基本一致.实验表明VP2高变区大多数氨基酸的变异与对细胞培养或组织的亲和性的关系更为密切.将4株克隆毒株的20代细胞毒免疫SPF鸡,40日龄进行攻毒实验,免疫效果明显,保护率几乎达到100％,二免后第14 d左右抗体浓度达到高峰.从抗体水平和病理组织学变化看,4株克隆化毒F20代中GX-IBDVE10C25CL4-20株免疫效果稳定,病理变化不明显,有望成为理想的疫苗株,为控制vvIBDV的感染提供一条新的途径. 相似文献
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鸡新城疫病毒感染不同细胞的病变特性研究 总被引：2，自引：1，他引：1
为了探讨鸡新城疫病毒(Newscastle disease virus,NDV)感染不同细胞的病变特性,选用NDV强、弱毒株感染鸡胚成纤维细胞(DF-1)、仓鼠肾细胞(BHK-21)和人宫颈癌细胞(HeLa).结果表明:NDV强毒株在DF-1、BHK-21、HeLa上均能增殖,在DF-1、BHK-21、HeLa上产生的细胞病变(cytopathic effect,CPE)以发生细胞融合和形成合胞体为主要特征,在DF-1上增殖速度较快,HA效价也高;NDV弱毒株含10μg/mL胰蛋白酶的DMEM培养基上,DF-1、BHK-21、HeLa可引起细胞变圆、脱落,没有典型的CPE,盲传15代CPE特征未发生改变,血球凝集(HA)效价较低.可见,NDV在其种属来源相同的DF-1中更适宜增殖,DF-1可用作NDV感染的最佳细胞模型. 相似文献
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【目的】研究消毒剂酸性硫酸钙（ACS）对微生物的杀灭效果,为用消毒剂防控人畜疫病提供基础数据和理论依据。【方法】将ACS与中和剂（3%卵磷脂、5%吐温-80的磷酸盐缓冲液）共孵育一段时间后,再分别加入大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）共培养一段时间,将与细菌的混合物涂布于营养琼脂平板,置于37℃生化培养箱培养18—24 h;将与病毒的混合物接种于细胞板,在37℃细胞培养箱内培养一定时间,评价中和剂的中和效果。其对照设置和评判标准如下：消毒剂+菌悬液或病毒悬液（第1组）,（消毒剂+菌悬液或病毒悬液）+中和剂（第2组）,（中和剂+消毒剂）+菌悬液或病毒悬液（第3组）,（无菌硬水+菌悬液或病毒悬液）+中和剂（第4组）,（无菌硬水+菌悬液或病毒悬液）+PBS（第5组）,无菌硬水+PBS（第6组）;细菌杀灭试验中和剂效果评价标准：第1组有极少量细菌生长或无菌生长,第2组有菌生长且明显少于第3、4、5组但多于第1组,第3、4、5组细菌数接近且与阳性对照组细菌数接近,第6组无菌生长,3次重复试验均符合上述条件,结果一致,判定所选中和剂及浓度合适;病毒灭活试验中和剂效果评价标准：第1组有极少量病毒生长或无病毒生长,第2组有病毒生长且明显少于第3、4、5组但多于第1组,第3、4、5组病毒生长与原接种量相近,第6组细胞正常生长,3次重复试验结果一致,判定所选中和剂及浓度合适。利用悬液定量杀菌法和测定病毒滴度的方法评价ACS对上述细菌和病毒的消灭效果,将ACS 稀释200、300、400、500、600、700倍分别与上述细菌或病毒作用不同时间后加入中和剂进行中和,然后将细菌混合物涂布于营养琼脂平板,通过计算菌落数评价ACS杀灭细菌的效果,测定病毒混合物中病毒滴度评价ACS对病毒的杀灭效果。【结果】所选用的中和剂能够有效地中和ACS 200倍稀释液对细菌和病毒的残留作用,且该中和剂对细菌、病毒和细胞无毒性。当ACS与细菌作用0 h后立即被中和,最大稀释300倍对大肠杆菌的灭菌率为100%,最大稀释600倍对金黄色葡萄球菌的灭菌率为100%,最大稀释700倍时对沙门氏菌的灭菌率为100%。当ACS 稀释至700倍时,分别与上述细菌作用1d或6d后被中和,灭菌率均为100%;此外,ACS稀释200倍时,与PRRSV作用60 min后被中和,未检测出病毒滴度。【结论】ACS稀释700倍与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌作用1 d或1 d以上均能产生较好的杀灭效果;ACS稀释200倍与PRRSV作用60 min能完全杀灭病毒。这可为养殖场选用消毒剂防控疫病提供参考。 相似文献
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为了研究新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)在鸡胚成纤维细胞DF-1中的增殖特性,将NDRV JDM10毒株接种到DF-1细胞,连续传代后,通过观察病毒对细胞的致病变效应,测定半数组织感染量(TCID50)、RT-PCR检测、间接免疫荧光(IFA)及Western-blot免疫学检测,探索NDRV对DF-1细胞的作用效果。结果表明,NDRV JDM10毒株在DF-1细胞中能有效增殖,产生明显的致病变效应;RT-PCR检测成功扩增出1条大小为1 001 bp的条带;病毒蛋白在细胞中获得了良好的表达,并与抗NDRV σC单克隆抗体发生特异性反应;NDRV JDM10毒株在感染DF-1细胞后会经历潜伏期、快速增长期、稳定期3个时期,并在72 h病毒效价达到峰值,TCID50为1×10-7.90·(0.1mL)-1。本研究为进一步研究NDRV的致病机理和研制细胞疫苗奠定了基础。 相似文献