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自英国引进3株荧光素标记的针对狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体,建立狂犬病直接免疫荧光诊断技术。根据已知狂犬病毒核蛋白和糖蛋白基因序列,参照已发表文献,设计合成4对PCR引物和2对克隆引物,以弱毒疫苗毒株为阳性对照,建立狂犬病RT-PCR及套式PCR诊断技术。自牟定采集发病犬脑组织样品15份,免疫荧光及PCR诊断结果均为阳性。对病毒N基因和G基因全序列经RT-PCR扩增,克隆至pMD18-T载体进行测序（登录号分别为：EU095330、EU253477）,并与已知代表毒株对应序列进行比对及系统发育分析,结果表明：云南牟定狂犬病毒属于基因Ⅰ型和血清Ⅰ型毒株,与近年从广西、浙江、江苏、湖北等省分离的毒株遗传关系密切,在系统发育树中形成同一小分支并均属于亚组群Ⅱ毒株。 相似文献
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狂犬病是由狂犬病毒感染引起的一种严重侵害中枢神经系统的致死性人畜共患传染病,呈世界性分布,我国属于疫病高发区.基于病毒N基因结构和变异特征,将狂犬病毒分为2个进化组群、7个基因型[1].国内外已研究建立了一批狂犬病诊断方法[2-4],开展病毒基因结构特征及分子流行病学研究[5-7].至今未见对近年云南狂犬病研究报道.本文在云南省4个地区开展狂犬病病原学监测,并对病毒N基因进行克隆测序,以期认识狂犬病分布状况、病毒特征及与已知毒株的遗传相关性. 相似文献
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马流感能引起马属动物的高度接触性呼吸道传染病。该病毒已知仅存在H7N7(马流感病毒1型)、H3N8(马流感病毒2型)两个亚型,目前仅H3N8亚型毒株在全球范围内引起马流感流行和暴发。采用A型及H3亚型特异性RT-PCR技术,检测云南疑似马流感病例鼻腔棉拭子样品;HA基因PCR扩增产物经纯化后,克隆至pMD18-T载体进行测序,并与已知代表性毒株对应序列进行比对及系统发育分析。研究发现云南马流感病毒与已知代表毒株血凝素基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别介于91.2%~99.2%和89.5%~98.4%,属于美洲谱系(American lineage)佛罗里达亚谱系(Florida sub-lineage)毒株。 相似文献
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以灭活的狂犬病病毒CVS株细胞毒免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA法和Western-blot筛选获得针对磷蛋白的单克隆抗体4株：1C9、4B10、2G12、4G5,其中1C9针对氨基端保守表位。以亲和层析法纯化1C9单抗腹水,异硫氰酸荧光黄标记制备荧光抗体。以1C9磷蛋白荧光抗体与本实验室研制的狂犬病核蛋白免疫荧光抗原检测试剂盒,对本实验室收集的501份疑似狂犬病鼬獾、蝙蝠、犬和黄鼬的脑组织样品进行直接免疫荧光平行检测。结果显示,两种检测手段对基因1型狂犬病毒的检出结果完全一致,而蝙蝠源Irkut病毒仅能以磷蛋白单抗1C9检出。本研究成功获得了与我国现有不同基因型狂犬病毒良好反应的抗狂犬病磷蛋白单抗,并应用于狂犬病的直接免疫荧光检测,为狂犬病诊断提供了敏感性和可靠性良好的诊断试剂。 相似文献
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为建立可以同时检测犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的CDV N蛋白序列和CPV NS基因保守序列,设计合成2对特异性引物。通过优化反应条件,对CDV阳性病毒株反转录后的cDNA模板和CPV的DNA模板进行双重PCR扩增,同时得到2条与试验设计相符的669 bp(CDV)和392 bp(CPV)特异性条带,建立了同时检测CDV和CPV的双重PCR方法。实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测这2种病毒,而对犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型、狂犬病毒检测均为阴性;CDV和CPV的最低检出限分别为101.8TCID50和101.4TCID50。采用该方法对在黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为30%;CPV阳性率为23.33%,表明建立的PCR方法可以用于临床诊断。 相似文献
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本试验旨在对北京1株犬源狂犬病病毒株(BJ2012ZW株)在全基因组水平上进行分子进化研究,比较与全国流行株及疫苗株之间的差异.试验采集犬脑组织以直接免疫荧光技术和内基氏小体检查方法进行检测,以RT-PCR扩增病毒核酸覆盖全基因组,对产物测序后进行遗传学分析.结果显示,BJ2012ZW株狂犬病病毒属于基因1型,与目前中国的主要流行株全序列同源性为83.9%~99.7%.与同样分离自北京的毒株BJ2011E和CNM1101C的核苷酸全序列同源性最高(99.7%),进化关系近.G蛋白主要抗原位点分析结果表明,BJ2012ZW株与国内疫苗株相比有部分抗原位点发生了替换.BJ2012ZW株属于中国目前的流行株,与目前国内所使用的疫苗株存在一定的差异. 相似文献
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2006~2009年自云南曲靖(YNQJ07、YNQJ08)、昭通(YNZT07、YNZT09)、楚雄(YNMD06)、保山(YNTC06)、红河(YNHH09)、怒江(YNNJ08)分离获得8株狂犬病毒,对其P和M基因进行克隆、测序,并与已知国内外代表毒株进行比对及系统发育分析。结果:云南狂犬病毒P基因核苷酸与氨基酸序列同源性分别为84.8%~99.4%和90.6%~99.3%;M基因核苷酸与氨基酸序列同源性分别为88.7%~99.5%和94.3%~100%;它们均属于基因Ⅰ型毒株,存在2个进化亚组群(Ⅰ、Ⅲ);YNTC06与泰国和YN0601H、YN0701H毒株遗传关系密切,属于亚组群Ⅲ毒株;其余地州分离毒株均属于亚组群Ⅰ毒株,进一步可划分为2个不同进化亚分支,YNMD06属于分支Ⅰ,与近年江苏、安徽毒株遗传关系密切;分支Ⅱ包括YNQJ07、YNZT07、YNQJ08、YNNJ08、YNZT09、YNHH09,与湖南、贵州毒株遗传关系密切。亚组群Ⅰ毒株已成为当前我国狂犬病流行的优势毒株,亚组群Ⅰ的第Ⅱ分支毒株在云南省广泛分布。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(8):1324-1329
通过查明辽宁省猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)的传染来源及其病原变异情况,为建立有针对性的诊断与防制方法提供基础依据。采集辽宁某猪场疑似伪狂犬病病死仔猪的脑组织病料,应用非洲绿猴肾(Vero)细胞分离培养,通过电子显微镜观察、病毒中和试验、聚合酶链反应、病毒TCID50测定和动物试验对所分离的病毒进行鉴定。结果确认从辽宁省成功分离到1株猪伪狂犬病病毒野毒株,暂命名为PRVLN/1301株。应用猪伪狂犬病毒(PRV)标准株设计引物对分离到的病毒进行gE和TK基因PCR扩增、T-A克隆、测序,成功扩增克隆出猪伪狂犬病病毒辽宁株PRVLN1301的主要毒力基因gE和TK基因序列。通过系统进化树分析表明该毒株与国内外参考毒株的同源性均在97%以上,核苷酸序列分析结果显示所分离的PRVgE基因存在第995位点由C-A的突变、第999位点由T-G的突变,氨基酸序列比对结果显示存在1个氨基酸L-Q位点的变化,即由亮氨酸变为谷氨酰胺,TK基因没有变异和缺失。说明该毒株与其他地区毒株为同一来源,但存在部分位点的变异。 相似文献
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为诊断疑似牛狂犬病病例、分析其病原分子特征,本研究以疑似牛狂犬病脑组织为研究对象,运用内基氏小体染色观察、荧光抗体试验、特异性目的基因(N基因)RT-PCR扩增和序列测定等方法进行病毒鉴定,使用DNAStar、Mega4.0软件分析N基因的遗传进化关系。内基氏小体检测、荧光抗体试验、乳鼠脑内接种试验和特异性目的基因扩增结果显示狂犬病毒阳性,建立了基于狂犬病毒N基因的遗传进化关系树。结合临床症状确诊该病例为牛狂犬病,遗传进化分析表明本研究鉴定的狂犬病毒和2006年及2007年国内狗源狂犬病毒(DQ666306、DQ866121)、猪源狂犬病毒(DQ496219)及人源狂犬病毒(EF556197)的遗传关系较近。本文为研究牛狂犬病毒分子流行病学积累了资料。 相似文献
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猫疱疹病毒1型PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立一种猫疱疹病毒1型的PCR检测方法,根据猫疱疹病毒1型的gD基因序列设计了1对特异性引物,以猫三联疫苗为模板,扩增出1125bp的目的基因片段,该产物序列与GenBank上公布的基因序列同源性为100%。特异性和敏感性试验表明,该方法对犬三联疫苗、猪伪狂犬病弱毒苗均无交叉性反应;并且最小可检出含有103个拷贝的样品。使用此PCR方法与间接免疫荧光分别对30个临床样品进行了检测,表明其可从24个间接免疫荧光检测阳性样品中检出23个阳性,符合率为95.8%。本研究初步建立了快速检测猫疱疹病毒1型的PCR方法,为猫传染性鼻气管炎的检验检疫及临床早期诊断奠定了基础。 相似文献
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从广东四会某猪场分离到一株疑为猪伪狂犬病病毒(PRV)的病毒,病毒在猪肾细胞上出现细胞变圆、拉网、融合等典型病变,并具有细胞泛嗜性特点。在MDCK细胞上测得其TCID50值为10-8/0.1mL,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和。将0.1mL病毒液接种小鼠后发生奇痒并麻痹致死,接种猪3天后发病,7天死亡,从攻毒病死猪的脑组织病理切片上观察到典型的病毒性脑膜脑炎及血管套现象。通过PCR扩增到PRVgD基因,由此进一步证明所分离病毒为猪伪狂犬病毒,并命名为GDSH株。根据GenBank中发表的序列,设计一对扩增PRVgE基因的特异性引物,建立可以区分PRV野毒株与疫苗株的PCR诊断方法。以此方法对病毒的细胞培养液进行检测,结果证实所分毒株为PRV野毒株,经克隆测序后与GenBank收录的其它PRVgE基因序列进行比较,发现所测毒株的核苷酸序列与其它PRV毒株的同源性介于98.3%～99.9%之间,其中与PRVEa株的亲缘关系最近为99.9%。 相似文献
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犬类几种常见传染病诊断中基因芯片的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
采用PCR技术扩增出犬腺病毒(CAV)ORF(P-VIII)基因、犬细小病毒(CPV)VP2基因、鸡血红蛋白的珠蛋白基因片断;采用RT-PCR扩增出犬冠病毒(CCV)纤突蛋白(S)基因、犬瘟热病毒(CDV)融合蛋白(F)基因、犬副流感病毒(CPIV)核衣壳结构蛋白(NP)基因、狂犬病病毒(RV)核蛋白(N)基因的各一段保守序列,纯化后点在硝酸纤维素膜上,制成基因芯片。通过RT-PCR将生物素标记到被检样品的核酸上,将已经标记的扩增产物与诊断基因芯片进行特异性的逆向点杂交,然后扫描仪对芯片进行扫描分析、判断。结果表明,此方法比病毒分离、HI、PCR方法灵敏度高、特异性强,平均检出率要高20%以上,并可同时对犬多种疫病进行快速诊断。 相似文献
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鸡腺胃型传染性支气管炎病毒金坛分离株核蛋白基因分析及与标准强毒株同源性比较 总被引：1，自引：0，他引：1
根据已发表的鸡传染性支气管炎病毒 (infectious bronchitis virus,IBV) Beau株、M41株的核苷酸序列 ,设计并合成 1对引物。应用该引物 ,通过 RT- PCR扩增出 IBV金坛分离株 (JT株 )的核蛋白基因 (N基因 ) ,片段大小为 82 8bp,与设计相符。对 JT株的 N基因进行序列测定 ,并与标准毒株 KB85 2 3、CU - T2、Beau和 M41的 N基因进行同源性比较 ,结果表明 ,JT株与 KB85 2 3、CU- T2、Beau和 M41毒株的 N基因同源性分别为 87%、87%、86 %和 85 %,说明 JT株与标准毒株在 N基因上存在一定的差异。 相似文献
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《畜牧与兽医》2015,(7):17-20
从福建省某猪场采集疑似猪伪狂犬病的病料接种PK-15细胞,通过PCR法、动物试验证实所分离的病毒为猪伪狂犬病毒(PRV),命名为FZ-2012,经测定该病毒株TCID50为10-9.40/0.1mL。根据Gen Bank已公布的PRV gE基因序列设计了1对特异性引物,将PCR扩增片段进行克隆测序,与国内外已发表的2012年以来15个新分离毒株、11个经典毒株进行同源性比对分析,并构建遗传进化树。结果表明:FZ-2012株gE基因序列全长1740 bp,编码579个氨基酸,与新分离毒株gE基因氨基酸序列的同源性为97.6%~99.3%,与经典毒株的氨基酸序列同源性为95.0%~98.6%;遗传进化关系表明,FZ-2012毒株与新分离毒株同属一分支,而与经典毒株分属2个不同分支。本研究首次报道福建省存在PRV新流行毒株,为丰富福建省猪伪狂犬病的分子流行病学和开发猪伪狂犬病新型疫苗奠定基础。 相似文献
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狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)引起的几乎所有温血动物都易感的人兽共患病。近年来,内蒙古地区发生了多起家养动物和野生动物疑似狂犬病疫情,给当地养殖业造成巨大损失。利用直接荧光抗体试验对2014-2016年内蒙古自治区发生的5起野生狐狸、牛、骆驼和犬的疑似狂犬病疫情进行诊断。经确诊,上述疫情均为RABV引起的。通过RT-PCR和核苷酸序列测定,获得6株病毒全长N基因序列,使用DNAStar和MEGA等软件将上述序列与周边省份和临近国家的流行毒株进行同源性比较和系统进化分析。研究结果显示,6株毒株核苷酸同源性为98.8%~99.9%,6株毒株均属于世界群草原型RABV,该型毒株在俄罗斯、蒙古、哈萨克斯坦的野生狐狸、狼群中广泛传播,本研究首次发现该型毒株已经由野生狐狸传播至犬群。进一步研究发现,内蒙古动物狂犬病传播来源包括野生狐狸、貉、犬等,流行的毒株类型包括亚洲1群、世界群和北极相关群,这些使得内蒙古成为我国狂犬病疫情最为复杂的地区之一,增加了该地区狂犬病防控难度。本研究通过对近年来内蒙古动物狂犬病进行流行病学分析,针对性地提出了内蒙古动物狂犬病防控措施。 相似文献