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1.
提取鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA作模板,用TD-PCR技术从其中分别扩增出0.55 KB的I型菌毛结构基因(piliA).将扩增得到的piliA基因片段,用TA克隆的方法分别克隆进pGEM-T栽体中,转化至受体菌JM109中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法,得到舍阳性重组子的菌株,提取质粒用PstI单酶切及NcoI和PstI双酶切鉴定,结果证实,所构建的克隆质粒中均含有相应piliA基因.经DNA序列分析,其结构基因阅读框架大小为549 bp,但其中O1菌株Ⅰ型菌毛基因在第72位发生突变,有6个碱基插入.经DNAStar核酸分析软件分析,3个基因同源性为89.9%～92.0%. 相似文献
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提取鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA作为模板,用TD-PCR技术从其中分别扩增出了0.55kb的Ⅰ型菌毛结构基因(piliA).将扩增得到的piliA基因片段,用TA克隆的方法分别克隆进pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法,得到含阳性重组子的菌株,提取质粒用PstI单酶切及NcoI和PstI双酶切鉴定,结果证实,所构建的克隆质粒中均含有相应piliA基因.经DNA序列分析,其结构基因阅读框架大小为549 bp,但其中O1菌株Ⅰ型菌毛基因在第72位发生突变,有6个碱基插入.经DNA Star核酸分析软件分析,此3菌株的Ⅰ型菌毛基因的同源性为89.9%～92%. 相似文献
3.
提取鸡致病性大肠杆菌分离株O1，O2和O78的基因组DNA作为模板，用TD－PCR技术从其中分别扩增出了0．55kb的I型菌毛细菌基因（piliA)，将扩增得到的piliA基因片段，TA克隆的方法分别克隆进pGEM-T载体中，转化至受体菌JM109中，用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法，得到含阳性重组子的菌株，提取质粒用PstI单酶切及NcoI和PstI双酶切鉴定，结果证实，所构建的克隆质粒中均含有相应piliA基因，经DNA序列分析，其结果基因阅读框架大小为549bp，但其中O1菌株I型菌毛基因在第72位发生突变，有6个碱基插入，经DNA Star核酸分析软件分析，此3菌株的I型菌毛基因的同源性为89．9％－92％。 相似文献
4.
3株致病性鸡大肠杆菌P型菌毛结构基因的克隆、序列测定及同源性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
用鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA做为模板，PCR分别扩增出了0．55kb的P型菌毛结构基因(papA)。将扩增得到的3个papA基因片段分别克隆进pGEM—T栽体中，转化至受体菌JM109中，用Amp／IPTG／X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法，得到含阳性重组子的菌株，提取质粒后用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切进行鉴定。所得阳性重组子进行DNA序列测定，测序结果经DNA Star核酸分析软件包分析比较，结果表明，所构建的克隆质粒中均含有相应完整papA基因，其开放式阅读框架大小为549bp，编码182个氨基酸。此3株菌的P型菌毛结构基因的同源性为98.9％～100％，其中O1株和O78株的P型菌毛基因的ORF序列100％相同，O2株有2个碱基与前两者不同。 相似文献
5.
用限制性内切酶SacI和BamHI双酶切克隆有鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的piliA基因的质粒pTFimO1、pTFimO2和pTFimO78，分别回收从此3质粒上切下的545bp的piliA基因片段，再将载体pET-28a( )用SacI和BamHI双酶切，最后将pET-28a( )DNA片段与545bp的piliA DNA片段进行连接，转化至受体菌BL21（DE3）中，经SacI和BamHI酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒pETFimO1、pETFimO2和pETFimO78。重组菌株BL21（DE3），（pETFimO1)、BL21（DE3）（pETFimO2)和BL21（DE3）（pETFimO78)经IPTG诱导后，其表达产物经SDS－PAGE检测，结果表明重组菌株可以良好地表达鸡致病性大肠杆菌I型菌毛蛋白。 相似文献
6.
用限制性内切酶SacI和BamHI双酶切克隆有鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的piliA基因的质粒pTFimO1、pTFimO2和pTFimO78,分别回收从此3质粒上切下的545bp的piliA基因片段,再将载体pET-28a(+)用SacI和BamHI双酶切,最后将pET-28a(+)DNA片段与545bp的piliA DNA片段进行连接,转化至受体菌BL21(DE3)中,经SacI和BamHI酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子质粒pETFimO1、pETFimO2和pETFimO78.重组菌株BL21(DE3) (pETFimO1)、BL21(DE3)(pETFimO2)和BL21(DE3)(pETFimO78)经IPTG诱导后,其表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明重组菌株可以良好地表达鸡致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛蛋白. 相似文献
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8.
根据Genebank中已登录的大肠杆菌O157:H7菌株EDL933基因序列中茵毛分子伴侣ycbR基因序列设计1对引物,并分别在其5'端分别加入Neo I、Xho I酶切位点,以大肠杆菌O157:H7国内分离株97094的DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出710 bp的DNA片段.回收并纯化该DNA片段,用限制性核酸内切酶Nco I、Xho I同时消化DNA片段和双酶切栽体质粒pET28a(+).将它们回收纯化并连接,然后转化到宿主菌大肠杆菌DH5a,从该菌中提取重组质粒,用PCR、限制性内切酶位点分析及核苷酸序列测定法对克隆的重组质粒进行鉴定,表明ycbR基因定向克隆到了载体质粒pET28a(+).再将重组质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),在含Kan抗生素LB培养基中经IPTG诱导12～16 h,做SDS-PAGE分析,表明ycbR基因在菌株中获得高效表达,表达蛋白相对分子质量大小约为30 000,与预期结果一致.为研究大肠杆菌ycbR基因产物的功能和致病作用奠定了基础. 相似文献
9.
禽源和猪源大肠杆菌1型菌毛主要亚单位抗原多样性分子基础的初步研究 总被引：2，自引：0，他引：2
从禽源大肠杆菌037(O78)、166(O78)、120(O18)分离株和猪源大肠杆菌107/86分离株分别提取基因组DNA,并以此为聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)的模板,扩增上述分离株的1型菌毛主要亚单位结构基因pilA,得到了大小约570bp的扩增产物,将此扩增产物克隆于T载体,通过内切酶酶切分析得到4个阳性重组质粒;对上述4个大肠杆菌分离株的pilA基因进行序列测定,通过其编码的主要菌毛亚单位FimA蛋白氨基酸的序列比较发现:3个禽源株间FimA的同源性为94.3%至99.0%;禽源株和猪源株间FimA的同源性为89.6%至91.1%。在pilA开放性阅读框所编码的FimA182个氨基酸序列中,禽源大肠杆菌O78血清型的2个分离株037株和166株间只有2个氨基酸不同,其同源性为99.0%。 相似文献
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鸡源致病性大肠杆菌1型菌毛pilA基因的PCR扩增、克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
研究选择从四川规模化鸡场分离鉴定的5株优势血清型鸡源致病性大肠杆菌代表株(O89,O119,O141,O127)的1型菌毛pilA基因的PCR扩增片段分别定向克隆到pUC18质粒的多克隆位点,并转化到DH5 α株大肠杆菌载体菌中,对目的基因的序列测定结果表明：5个克隆片段均含有1型菌毛pilA基因的全序列,全长459bp,编码信号肽和结构蛋白。用生物软件(DNASTAR)对9株大肠杆菌1型菌毛pilA基因序列、氨基酸序列、菌毛蛋白质二级结构预测及抗原性进行了分析比较,结果显示：鸡源致病性大肠杆菌1型菌毛间具有同源性,1型菌毛间存在一定的相同抗原位点。 相似文献
11.
猪白细胞介素-6的原核表达及其生物学活性研究 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究采用RT-PCR方法自细菌脂多糖(LPS)刺激的猪脾脏细胞总RNA中扩增、克隆猪白介素-6(porcine interleukin-6,PoIL-6)成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的重组融合猪白介素-6(rPoIL-6)蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS透析等步骤进行复性、纯化,采用PoIL-6 ELISA试剂盒检测rPoIL-6蛋白与抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应的活性;采用MTS法检测rPoIL-6蛋白促猪脾脏细胞的增殖活性。结果表明,成功克隆了全长555 bp的PoIL-6成熟肽基因;表达的rPoIL-6蛋白分子质量大小约20 ku;纯化后的rPoIL-6蛋白纯度在95%以上,可和抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并且具有显著促猪脾脏细胞增殖活性。 相似文献
12.
从人的乳腺组织中克隆了人乳铁蛋白(hLF)cDNA,其DNA序列与GenBank中另外4个hLF cDNA序列具有高度的同源性(同源性达到99%)。将人乳铁蛋白cDNA克隆在质粒pBacPAK8的BamHⅠ位点和XhoⅠ位点,构建成重组转移质粒pBacPAK-hLF。该质粒DNA与已线性化BacPAK6DNA共转染家蚕细胞BmN,在培养的贴壁细胞中挑出空斑,经过3轮纯化,获得重组病毒BmNPV-hLF。蛋白质免疫印迹法检测到在重组病毒感染的家蚕细胞中存在人乳铁蛋白基因的表达产物,分子量约78kD,ELISA法测定结果表明家蚕细胞中重组人乳铁蛋白(rhLF)相对表达量在表达120h达到最高值,约为13.5mg/L。体外生物活性试验表明重组hLF对大肠杆菌JM109具有抑菌活性。 相似文献
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犬α干扰素的克隆、表达及纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
根据DDBJ/GenBank基因库中已登录的犬α干扰素序列,设计了含SphⅠ和HindⅢ酶切位点的一对引物,采取聚合酶链式反应(PCR)技术以犬基因组DNA为模板进行了CaIFN-α的成熟肽基因的克隆,扩增产物与克隆载体pGEM-T Easy Vector连接后转入大肠杆菌JM109,经PCR鉴定和EcoRⅠ酶切鉴定,初步证实为CaIFN-α,用SphⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒,将目的片段与表达载体pQE30连接,然后转入大肠杆菌JM109,经PCR鉴定、SphⅠ和HindⅢ双酶切鉴定、序列测定证实已经成功克隆了CaIFN-α,构建了重组表达质粒PQE30/CaIFN-α。将重组表达菌液培养至OD600为0.5时加入IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析CaIFN-α在大肠杆菌中得到了表达,表达的目的蛋白以包涵体形式存在,表达量约占细菌总量的20%左右。将诱导表达的菌液经超声裂解、变性、复性、透析后,得较纯的CaIFN-α蛋白。本研究为以后CaIFN-α的活性及临床应用研究奠定了基础。 相似文献
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猪伪狂犬病病毒XIN-W株gD和gE基因的克隆及序列分析 总被引：4，自引：0，他引：4
根据已发表的PRVgD、gE基因序列 ,设计合成了两对引物 ,对猪伪狂犬病病毒XIN W株相关的毒力基因gD、gE序列进行测定和分析。经PCR扩增分别得到了全长为 12 0 9bp,1 743bp的gD、gE全基因序列 ,将它们克隆到pGEM T Easy载体中 ,并转化JM1 0 9,挑取阳性菌落的质粒进行PCR、酶切、测序鉴定 ,与其他参考毒株的gD、gE基因进行比较。结果表明 ,XIN W株与其它毒株相比 ,gD、gE基因核苷酸序列的同源性分别为 97.9%～99.3 % ,98.0 %～ 98.7% ;氨基酸序列的同源性分别为 97.0 %～ 99.3 % ,97.1 %～ 98.1 %。不同的PRV毒株间gD、gE基因在核苷酸水平和氨基酸水平高度保守。遗传进化树显示 ,XIN W株和国内其它毒株起源相同 ,属同一进化分支 相似文献
15.
采用LA—PCR技术扩增牛Nramp1基因2515bp的5′调控区序列,构建了重组克隆载体pEASY—T3-Nramp1,对阳性克隆进行了PCR扩增、限制性酶切鉴定、DNA测序及生物信息学分析。结果表明,试验成功构建了包含Nramp1基因5′调控区的重组质粒。经同源性比对发现,Nramp1基因5′调控区在不同物种中具有一定的保守性,在转录起始位点近端的启动子区域,牛与人、鼠、猪、羊的同源性分别是60．50％,58．52％,72．18％,81．95％。经预测．该调控区富含GR、SP1、c—Ets-1、NF—W2等转录因子结合住点。本研究为进一步确定牛Nramp1基因核心启动子区域及该基因的表达调控奠定了理论基础。 相似文献
16.
应用RT-PCR技术,用特异性引物扩增出SVDV HK’70 5’和3’非编码区,并将目的片段连接于pMD18-T载体,转化JM109感受态细胞。重组质粒经双酶切、PCR鉴定后测序。核苷酸序列比较结果表明,SVDV HK’70 5’非编码区与参考毒株SVDV J1’73、SVDV H/3’76核苷酸的差异率分别为1.6％、1.9％;SVDV HK’70 3-NCR与参考毒株SVDV J1’73、SVDV H/3’76核苷酸的差异率分别为1.0％、1.0％。应用计算机软件对3个SVDV毒株非编码区的二级结构进行预测,结果表明,SVDV HK’70 5’非编码IX-"级结构中存在13个结构域,SVDV J1’73 5’非编码区二级结构中存在9个结构域,SVDV H/3’76 5’非编码区二级结构中存在10个结构域;SVDV HK’70 3’非编码区二级结构中存在3个结构域,且与其他的两个毒株SVDV J1’73、SVDV H/3’76基本相同。 相似文献
17.
大肠杆菌肠毒素ST1b基因的亚克隆及其核苷酸序列分析 总被引：3，自引：1，他引：2
以大肠杆菌pSLM004菌株为始发菌株,利用合成的一对与ST_1基因特定序列相匹配的引物,通过PCR扩增出了ST_(1b)基因。该基因片段扩增物经适当纯化,与克隆载体pUC18的HincⅡ切点平端连接,转化到受体菌JM101中。利用Ap抗性作为压力选择标志以及LacZ基因插入失活显色反应,在Ap/Xgal-IPTG培养基上,筛选出转化子。将白色菌落转化子经酚/氯仿法抽提重组质粒,利用所扩增ST_(1b)基因片段上所设计的BglⅡ位点及pUC18载体具有的PvuⅡ切点,经酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子pBST2-6。该重组质粒经双脱氧法双向核苷酸序列分析,确定了插入的ST_(1b)基因与载体的连接向位及其全部核苷酸序列。 相似文献
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禽传染性支气管炎病毒S1基因玉米表达载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
禽传染性支气管炎病毒主要编码3种结构蛋白,其中S蛋白的S1蛋白是宿主的主要保护性抗原,能诱导机体产生中和抗体和血凝抑制抗体,并与病毒的组织嗜有关.本研究选取具有代表性的禽传染性支气管炎病毒分离株SAIB14和SAIB4,以其S1基因克隆质粒pUCSAIB14和pUCSAIB4为模板,用具有高保真度的pfu酶分别扩增,得到含先导序列的S1基因片段.把扩增产物分别通过ClaⅠ和BamHⅠ酶切纯化,替换中间载体pUGFPocs的GFPm1基因,构建中间表达载本pUSAIB14和pUSAIB4.用KpnⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pUSAIB14和pUSAIB4,回收Ubi-S1-Tocs片段,定向插入到pCAMBIA 300载体的多克隆位点.经酶切和PCR鉴定,证明获得了S1基因的玉米表达载体pCUSAIB14和pCUSAIB4.外源基因导入受体植物能否有效表达,表达载体构建是关键因素,构建时选用表达载体的类型、启动子和终止子、目的基因插入位点等都有影响.本研究用BarHⅠ和ClaⅠ双酶切载体pUGFPocs,用S1基因扩增片段替换GFPm1基因,将S1基因置于Ubi启动子和T-ocs终止子的控制之下,有助于S1蛋白的高效表达,最后将Ubi-S1-Tocs单元HindⅢ和KpnⅠ双酶切下来,插入到pCAMBIA1300的多克隆位点,得到可用于农杆菌介导的转化或直接转化的植物表达载体pCUSAIB4和pCUSAIB14. Ubi启动子来自玉米,属组成型启动子,内含有一个内含子和外显子,是已知的最强的单子叶植物启动子,外源基因在Ubi启动子的控制下,在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达.pCAMBIA1300是中国农业科学院作物遗传育种中心构建的植物表达载体,可用于农杆菌介导的转化或直接转化,载体中T-DNA左右边界内带有多克隆位点和筛选标记Hyg基因,Hyg基因是玉米和水稻转化试验中广泛使用的标记基因,编码潮霉素磷酸转移酶,适于玉米和水稻转化后用化学试剂潮霉素进行筛选转化体.多克隆位点处可插入外源基因,在农杆菌介导的转化中,由于卸甲载体的作用,植物表达载体T-DNA左右边界内的序列,包括外源基因和筛选标记基因部分,发生转移并进入植物细胞内,用筛选试剂潮霉素可有效筛选出整合有外源基因的转化体.转基因植物疫苗生产技术是利用分子生物学技术把重组的疫苗基因导入植物,并使植物能够大量表达重组蛋白的一类生物技术.与常规疫苗及其它新技术疫苗相比,转基因植物疫苗具有生产简单、安全、廉价及保存和运输方便等优点,由于其应用前景可观,已引起免疫学家、分子生物学家和植物学家的极大兴趣与关注.利用该技术国外至今已获得成功的有乙型肝炎表面抗原、不耐热的肠毒素B亚单位(LT-B)、诺沃克病毒外壳蛋白、流感病毒血凝素和艾滋病病毒抗原、口蹄疫病毒抗原和鼻病毒抗原、痢疾抗原等10多种疫苗,国内在利用转基因植物生产疫苗的研究方面还远远滞后于其他国家.本研究利用含先导序列的禽传染性支气管炎病毒S1基因,构建了玉米表达载体系统,为进一步在玉米中表达IBV S1基因提供了基础材料. 相似文献