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1.
荧光定量RT-PCR法对高致病性PRRSV变异株感染猪体内分布规律的研究 总被引：2，自引：1，他引：1
根据GenBank发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株Nsp2基因序列设计1对特异引物,以重组质粒作为阳性标准品,采用SYBR-Green Ⅰ嵌合荧光染料建立了1种荧光定量RT-PCR方法用于检测该病毒核酸载量,在101~106拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,相关系数为R2=0.999 8,扩增效率为E=0.950,对质粒标准品最低检测限为12.8拷贝/μL,重复性检测的变异系数低于2.0%。用高致病性PRRSV变异毒株人工感染25日龄非免疫仔猪,对不同时间采集的血清进行了病毒核酸定量检测,结果表明病毒血症于攻毒后48 h被检测出,于7~10 d达到高峰,其病毒核酸载量能达到106拷贝/μL。试验猪临床表现为体温升高至40.5℃以上,持续7~11 d;出现嗜睡、打喷嚏、眼结膜炎、偶见一过性的耳尖发绀、皮肤苍白或有小疱疹、被毛粗糙、消瘦、便秘、后躯无力等临床症状。感染猪发生高热期与毒血症消长规律有一定相关性。对人工感染猪体内病毒分布检测结果表明,以多种脏器均有病毒存在,如扁桃体、淋巴结、心脏、肾脏中含量较高,肝、脾脏和肺次之,脑组织中也检测到病毒存在。试验表明,该方法可用于PRRSV变异毒株核酸定量检测,为该病毒致病性、致病机理、疫苗免疫及诊断等方面的研究提供了技术手段。 相似文献
2.
《中国预防兽医学报》2020,(9)
为了研究我国广西地区流行的猪流感病毒分子特征和感染性,本研究对分离自广西临床健康猪群中的H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/swine/Guangxi/238/2018(H1N2)(简称GX238株)进行了分子进化分析和致病性研究。扩增该病毒株8个基因节段后进行分子进化分析,结果显示其8个节段均与2015年～2016年在美国分离的H1N2亚型SIV有高度同源性(98.9%～99.7%),其中HA基因可能来自于2009年之前的人季节性H1N1亚型流感病毒,PB2、PB1、PA、NP、NA和NS可能来自北美三重配H1N2亚型SIV,M基因可能来自H1N1/2009。以10~6EID_(50)SIV GX238株病毒鼻腔感染BALB/c小鼠后记录小鼠的体质量变化及死亡情况,感染后第3 d检测小鼠各脏器病毒复制情况。结果显示,感染组小鼠体质量与PBS对照组小鼠相比有明显下降趋势,感染小鼠40%死亡;在小鼠肺脏和鼻甲中病毒滴度分别达6.3 Log_(10)EID_(50)/mL、4.8 Log_(10)EID_(50)/mL,表明该病毒对小鼠表现出中等的致病力。本研究结果表明输入型SIV持续对我国猪群造成威胁,凸显了在世界范围内开展猪流感监测的必要性。 相似文献
3.
本研究应用猪瘟病毒通用引物和野毒特异性TaqMan探针,并以质粒作为阳性标准品,结合Corbett公司的RotorGene3000荧光定量PCR仪,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测猪瘟病毒核酸载量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在10^8-10^1范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10拷贝/μL的病毒核酸,与本实验室建立的RT-套式PCR（RT-nPCR）具有相近的敏感性,二者对152份不同样品检测符合率达94.7%。应用本方法对人工感染10^6TCID50猪瘟石门强毒的猪只感染后0-14 d全血中猪瘟病毒RNA进行了定量检测,揭示了猪瘟病毒在猪体内复制的动态变化,证实了感染猪临床表现与病毒滴度存在明显的时间相关性。此外发现,在同居感染猪出现猪瘟临床症状前3-4 d可从其全血中检出病毒RNA。 相似文献
4.
为了测定H1N1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)对小鼠的致病性,本试验对A/swine/Guangdong/2/2012(H1N1)株SIV HA基因进行克隆及遗传分析,并将SIV尿囊液经鼻腔感染6周龄BALB/c小鼠,观察感染后小鼠的一般状况、器官系数和组织病理学变化,在病毒感染后第1、3和7天使用荧光定量PCR测定小鼠肺脏、脾脏、脑组织中7种细胞因子mRNA的表达量,研究其对小鼠的致病特性。结果显示,该病毒属于经典SIV,病毒经鼻腔感染后可引起小鼠活动减少、采食量降低,但无咳嗽和死亡;病理组织学变化为肺间隔较正常组织明显增厚,毛细血管明显扩张充血,周围肺泡腔呈代偿性肺气肿;小鼠肺脏、脾脏组织样本中IFN-α、IFN-β、IP-10、IL-1β、TNF-α、IRF-3和IL-10 mRNA含量在感染后第3天均显著升高(P<0.05),而脑组织样本中IL-1β和IL-10在小鼠攻毒后第3和7天均显著上调(P<0.05)。 相似文献
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6.
猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×108至2.0×102拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为20个拷贝/μL。根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高、特异性好,可以进行定量分析,在猪流感的快速检测上具有重要意义。 相似文献
7.
《中国预防兽医学报》2010,(9)
为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIVM基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法。检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345bp)和PRRSV(520bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV2种病毒混合液的最小检出量分别为102EID50/0.1mL和103TCID50/0.1mL。应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒。证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测。 相似文献
8.
尼帕病毒与猪流感病毒双重荧光定量RT-PCR方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据尼帕病毒(NiV)M基因和猪流感病毒(SIV)M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA)和SIV M基因的RNA标准对照(SIV-M-RNA),定量线性范围分别为4.6×101copies/μL~4.6×108 copies/μL和5.8×101copies/μL~5.8×108 copies/μL,检出限分别为46个拷贝和58个拷贝。该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于1.6%,显示其良好的可重复性。该方法仅对NiV-M-RNA和SIV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应。用该方法对236份猪的鼻拭子样品进行NiV和SIV的同时检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,有1份样本的SIV检测结果为阳性。本研究建立的方法可为猪临床样本中NiV和SIV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 相似文献
9.
为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在猪体中的组织分布情况,针对PCV3 Cap蛋白基因设计筛选出一对特异性引物和探针,通过对荧光PCR引物、探针浓度进行优化,建立了基于TaqMan探针实时荧光定量PCR技术的PCV3检测方法,并应用该方法对人工感染PCV3猪的多种组织器官进行病毒含量检测。结果显示,建立的PCV3实时荧光定量PCR检测方法特异性较好且灵敏度高,可检测低至1 copy/μL的PCV3病毒核酸量,而对其他几种常见猪病毒病原的检测结果均为阴性。PCV3主要存在于肺脏、淋巴结,在扁桃体和脾脏中有少量存在。试验表明,所建立的荧光定量PCR检测方法可用于PCV3的快速定量检测,对PCV3在猪体中的组织分布情况的研究为进一步揭示PCV3的组织嗜性和致病机理提供理论依据。 相似文献
10.
刘新军 《国外畜牧学(猪与禽)》2015,(3)
非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)是猪的一种强毒型病原体,从2007年起在东欧流行,目前还没有有效的疫苗或治疗方法。ASF病毒是当前的流行毒株,在猪体内带毒和排毒(shedding and excretion)的动力学机理至今尚不清楚。因此,本试验希望通过将易感的家猪与经肌内注射感染ASF病毒格鲁吉亚2007/1毒株的家猪进行接触,以测定ASF病毒在猪栏内和猪栏之间由受感染猪向易感猪进行传播的动力学机理。试验采集了血液、口液、鼻液、肠液(直肠)样本,以通过病毒滴定法和实时定量PCR(q PCR)法检测ASF病毒,利用血清学试验测定ASF病毒特异性抗体。肌内注射和接触传播感染均能造成猪急性发病,不过试验表明因感染途径不同而导致猪的发病机制有所差异。接种感染猪在接种的第3天可在血液中分离到有传染性的ASF病毒,而通过直接接触和间接接触进行感染的猪分别在曝露后第10天和第13天方可从血液中分离到有传染性的ASF病毒。临近出现ASF临床症状时,ASF病毒在血液中的滴度高于在鼻液和肠液中的。口液样本中没有分离到有传染性的ASF病毒,不过ASF病毒的基因组被检测到。只有一头接种感染的猪在接种后第12天检测到ASF病毒特异性抗体。本项试验结果提供了ASF病毒格鲁吉亚2007/1毒株在家猪中带毒和排毒的定量数据,同时表明该毒株引起持续感染的能力有限。 相似文献
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为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测. 相似文献
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为确诊衡阳市某猪场育肥猪发生的疑似猪伪狂犬病(PR)疫情,采集发病猪脾脏,运用PCR方法进行猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸检测,利用非洲绿猴肾细胞(Vero)进行病毒分离培养,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)进行病毒血清学鉴定;用分离培养物进行家兔感染试验,观察临床症状和病例剖检变化,采用PCR检测各器官中的病毒分布情况。结果显示:病料接种Vero细胞培养3 d后,出现明显的细胞病变效应(CPE);分离培养的病毒与PRV阳性血清呈阳性反应;家兔感染后出现奇痒等神经症状并死亡,其肝、脾组织均为PRV gE核酸检测阳性。试验结果证实,分离到的病毒为PRV野毒,从而确诊了该疑似疫情。 相似文献
13.
为了解鸭坦布苏病毒感（Duck Tembusu virus, DTMUV）染麻鸭的组织嗜性和排毒情况,应用RT-PCR方法检测鸭坦布苏病毒在麻鸭体内各组织的动态分布及和泄殖腔棉拭子的排毒情况。结果显示最早在感染第1 d于心脏、脾脏、肺脏、气管、胰腺、直肠可检测到鸭坦布苏病毒核酸的存在;至第7、9 d时,在各组织脏器中均仍能检测到该病毒核酸;至第21 d时,仅能在脑、胰腺和直肠中可检测到病毒核酸。病毒在脑和直肠中时间最长（25 dpi）,胰腺（21 dpi）和肝脏（21 dpi）次之。对不同时间采集的泄殖腔棉拭子检测结果显示,于感染第1 d即能检测到该病毒核酸,25 d后即检测不到该病毒的存在。以上检测结果表明鸭坦布苏病毒感染雏麻鸭后能迅速入侵麻鸭各组织脏器,主要侵染肝、肺、肾、胰腺和直肠,并可通过粪便等途径向外界排毒。 相似文献
14.
2005～2006年广西地区猪流感的分子流行病学调查 总被引：3，自引：1，他引：2
为了解广西猪群中猪流感(Swine influenza,SI)的流行情况,本调查主要采用RT-PCR方法,对2005~2006年从12个规模猪场随机采集的530份猪鼻腔棉拭子(不同年龄段)和108个猪场送检的239份有呼吸道症状病猪的组织病料样品(肺、脾和淋巴结等)进行了SIV检测;同时,对SIV阳性组织病料样品进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)的检测,以确定猪群中SIV的感染以及与其他病毒混和感染情况。结果显示:从不同年龄段猪的鼻腔棉拭子中均能检测到SIV,且平均阳性率为15.85%(84/530)。从11个市30个猪场54份的组织病料中检出SIV,组织病料和猪场的平均阳性率分别为22.59%(54/239)和27.78%(30/108)。SIV常常与PRRSV、PCV2、CSFV、PPV和/或PRV二重或多重混和感染,占检测样品的19.25%(46/239),其中以SIV与PCV2和PRRSV混合感染最为常见,阳性率分别占检测样品的13.81%(33/239)和8.37%(20/239)。由此可见,SIV已经感染广西猪群,且SIV常与其他病原体以混合感染的方式对广西养猪业构成潜在危害。 相似文献
15.
为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量RT-PCR技术。结果显示,该方法的敏感性可达102拷贝/μL,除H1亚型SIV外,对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。本试验结果表明该方法特异性强、重复性好,有望成为一种特异、敏感、快速、定量检测H1亚型SIV的方法。 相似文献
16.
《中国动物传染病学报》2018,(5)
根据猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的保守序列,设计合成一套特异性引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化后,检测其特异性和灵敏性。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR在101～108范围内线性相关系数为0.997,能够检测到相当于10 copies/μL的病毒核酸,比常规PCR检测方法敏感性强;采用建立的实时荧光定量PCR方法检验猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型呈现阴性结果,特异性强;变异系数为0.09%～0.7%,小于1%,具有良好的重复性。本研究建立的猪瘟病毒实时荧光定量PCR方法为临床上猪瘟病毒的诊断和定量研究提供了重要的检测工具。 相似文献
17.
《猪业科学》2015,(4)
为了建立猪圆环病毒2型(PCV2)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×10~1拷贝/μL,与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、乙型脑炎病毒(JEV)核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。 相似文献
18.
类猪圆环病毒因子P1在自然感染仔猪体内的组织分布 总被引：1，自引：0，他引：1
选用3头自然感染仔猪和1头阴性对照猪,剖杀后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、脑、空肠、扁桃体、胸腺、淋巴结、膀胱、性腺等组织,用荧光定量PCR方法检测病毒在组织中的分布及病毒载量.结果显示,类猪圆环病毒因子P1分布在仔猪的心脏、肝脏、肺脏、胰脏、脑和膀胱等组织,病毒载量以胰脏、脑和膀胱为最高,可达105拷贝/g以上；对照猪脏器中没有检测到病毒核酸.该研究为P1的诊断及致病机制奠定了基础. 相似文献
19.
为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法，本研究根据GETV的nsP3基因设计特异性引物及探针，以GETV (SC483株) cDNA作为模板，扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中，构建重组质粒标准品p ET29a-nsP3并经PCR和测序鉴定。基于该质粒标准品，采用方阵法优化引物、探针浓度以及退火温度，初步建立了一种基于GETV nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，并绘制标准曲线。以GETV (SC483株、SC266株)、辛德毕斯病毒(SINV)、猪流感病毒(H3N2、SIV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)等病毒的基因组RNA反转录为cDNA作为模板，利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测，结果显示，仅GETV为阳性，SINV、SIV、TGEV、PEDV、PRRSV均为阴性，表明该方法特异性较强；分别以10倍倍比稀释(3.07×10-1拷贝/μL～3.07×108拷贝/μL... 相似文献
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SIV与PRRSV、CSFV、PCV-2和PRV交叉感染的检测 总被引：2，自引：0，他引：2
采用RT-PCR方法对37份疑似猪流感病毒(SIV)感染病料进行了病原学检测。同时,还运用PCR和RT-PCR方法对SIV阳性病料进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪伪狂犬病毒(PRV)目的基因片段的扩增。结果,扩增出了SIV特异目的基因片段,且4份病料都为混合感染,感染状况分别为SIV/PRRSV/PRV,SIV/CSFV/PRRSV三重感染,SIV/PCV-2和SIV/PRRSV二重感染。 相似文献