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《中国兽医学报》2019,(6):1099-1103
为获得含有缺失突变体病毒全基因组的番鸭小鹅瘟病毒(MDGPV)PT株缺失病毒并分析其生物学特性,本试验以含有MDGPV PT株全长感染性DNA克隆的质粒pMDGPVPT为模板,通过重叠延伸PCR方法将5′末端倒置重复序列(5′-ITR)第287位E盒基序(E-box)缺失,获得感染性重组质粒pPT△E287。pPT△E287经卵黄囊接种转染9日龄番鸭胚后拯救出缺失病毒rPT△E287。生物学特性试验显示,rPT△E287感染番鸭胚后能够引起特征性病变,与其亲本病毒株PT相比,rPT△E287的毒价及其在番鸭胚中增殖能力有所下降。本试验为进一步了解5′-ITR中E-box的缺失与MDGPV致病力之间的关系奠定基础。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2021,(5)
为制备杆状病毒表达系统表达的番鸭源鹅细小病毒(MDGPV)VP2蛋白形成的病毒样颗粒(VLPs),并测定其免疫原性,本研究通过PCR扩增得到MDGPV PT株VP2基因,通过杆状病毒表达系统构建了表达MDGPV VP2的重组杆状病毒MDGPV-rBV。以MOI 5的MDGPV-rBV感染Sf9细胞后,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测结果显示,MDGPV-rBV感染的细胞出现亮绿色荧光;western blot检测VP2蛋白,结果显示在约65 ku处出现特异性条带,表明VP2蛋白正确表达。收集MDGPV-rBV感染的Sf9细胞制备细胞超薄切片样品,同时超速离心富集病毒样品,分别经透射电镜观察,可在细胞核观察到与MDGPV病毒粒子二十面体形态一致的VLPs,直径约20 nm,表明表达的VP2能够组装成VLPs。按常规方法制备VLPs油佐剂疫苗,以42μg/只VLPs经胸部肌肉注射免疫130日龄番鸭,免疫后2至7周每周采血并分离血清,利用GPV胶乳凝集抑制试验(LPAI)和微量中和试验检测免疫番鸭的MDGPV抗体效价,结果显示免疫后抗体效价逐渐升高,至第4周达到峰值,随后平缓下降,免疫番鸭的LPAI效价及中和效价峰值分别为4.9±1.10 log2、7±1.15 log2,以上结果表明构建的MDGPV VLPs具有良好免疫原性。本研究为MDGPV VLPs在疫苗和诊断试剂的开发应用奠定了基础。 相似文献
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细胞自噬在病毒生命周期中发挥着重要作用，目前国内仍然没有鹅细小病毒(GPV)与细胞自噬关系的系统研究。本研究旨在探讨番鸭小鹅瘟病毒(MDGPV)PT株与短喙矮小综合征鹅细小病毒(SBDS-GPV) M15株细胞适应毒感染番鸭胚成纤维细胞(MDEFs)后对细胞自噬的影响，以及细胞自噬对病毒增殖的作用。通过激光共聚焦方法观察自噬标记物LC3-Ⅱ特异绿色荧光聚集颗粒，借助蛋白免疫印迹检测LC3蛋白与p62蛋白的表达量，以及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白转化分析，确定GPV感染能够促进细胞自噬发生。利用膜通透性半胱氨酸蛋白酶抑制剂阿洛司他丁、自噬诱导剂雷帕霉素以及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤，调控自噬来研究细胞自噬对病毒增殖的影响，结果显示细胞自噬有利于GPV在MDEFs中的复制。结果表明GPV感染能够诱导细胞自噬，同时细胞自噬有利于病毒在宿主细胞中的复制。 相似文献
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本研究从广东省某发病番鸭场分离得到的呼肠孤病毒(DRV)混合有番鸭细小病毒(MDPV)疫苗株.采用MDPV阳性血清中和后,经2轮番鸭胚有限稀释克隆获得纯化的DRV.电镜观察病毒粒子呈球形、无囊膜、双层衣壳、直径约70 nm.F6代病毒滴度为log107.5 TCID50/0.1 mL,病毒能够致番鸭胚成纤维细胞产生细胞病变,并能够致死番鸭胚和SPF鸡胚,回归1日龄雏番鸭出现典型的肝脏点状或斑块状出血等特征性病变,与临床发病鸭相同.分离株S3基因核苷酸同源性与太湖流域2011年分离株DRV-TH 11最高,为99.9％,与福建番鸭源分离株MDRV-J 18为98％;与早期MDRV在66.8 ％～67.2％之间,处于不同进化分支上.本研究分离株对番鸭胚、SPF鸡胚及雏番鸭致病力强,而且其基因序列比早期分离株变异较大,应加强监测并及时筛选新疫苗株以有效防控该病的发生和蔓延. 相似文献
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将本实验室保存的一株LaSota病毒用有限稀释法接种鸡胚进行纯化,连续传代5次后筛选到1株高血凝效价的纯培养克隆株,命名为LaSotaC5,并对其进行全基因组测序,克隆株与亲本株在生物学特性与基因序列上都存在一定的差异。参照LaSotaC5株全基因序列单酶切位点,用RT-PCR的方法将基因组分8段扩增,按照病毒基因组的结构顺序,将克隆片段定向插入到TVT转录载体中,成功构建含有病毒全长eDNA的转录载体TVT．LaSotaC5。将TVT-LaSotaC5与辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI—L共转染BSR—T7／5细胞,成功拯救出了具有感染性的LaSota株新城疫病毒。病毒的成功拯救为后续基因功能和疫苗载体开发等方面的研究提供了平台。 相似文献
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《中国兽医杂志》2015,(12)
本研究应用RT-PCR技术对孵化过程中死亡的不同品种种鸭胚进行常见病毒感染检测。结果表明,死亡的种鸭胚感染病毒种类多达9种,且首次从鸭胚中检测到禽坦布苏病毒(ATV)感染,不同品种的种鸭胚病毒感染率差异较大,以种番鸭胚感染率最高达58.82%。ATV囊膜蛋白(E)基因分析表明,3株种鸭胚ATV分离毒(PT15-4株、FJFQLL36株和PT15-27株)与GenBank中已发布鸭源ATV囊膜蛋白的核苷酸及氨基酸序列同源性分别在97.2%~99.8%及97.1%~99.4%之间,亲缘关系密切。动物试验表明,3株病毒对开产麻鸭的致病性不尽相同,其中PT15-4株和PT15-27株可引起麻鸭产蛋量显著降低及卵巢的出血病变,而FJFQLL36株病毒对麻鸭产蛋影响不明显,且未引起蛋鸭卵巢明显出血或卵黄液化病变。以上结果表明,我国种鸭胚中病毒性感染较为复杂,而且还出现了ATV的感染,尽管不同禽坦布苏病毒分离株间存在毒力差异,但均可从种鸭经卵传播到种蛋而成为新的传染源。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2015,(5)
为构建肠炎沙门氏菌(S.enterica)tu-fA基因缺失株及鉴定其生物学特性,本实验利用Red重组系统,以pKD3中的FRT-氯霉素抗性(cat~r)基因-FRT序列为模板,利用含有tu-fA基因两端序列的引物,经PCR扩增同源重组DNA片段(tu-fA5'-FRT-cat~r-FRT-tu-fA3'),将该DNA片段电转化于含有质粒pKD46的S.enterica SM6株中进行同源重组,通过氯霉素抗性筛选tu-fA基因缺失的SM6株(SM6△tu-f A::cat),再通过导入质粒pCP20于SM6△tu-fA::cat中敲除cat r基因,从而构建了tu-fA基因缺失株SM6△tu-fA。生物学特性鉴定结果表明,基因缺失株具有良好的遗传稳定性;与亲本株相比,细菌形态未发生明显改变,但基因缺失株体外生长速率略低,利用碳源的能力有所增强;缺失株侵袭Caco-2细胞的能力与亲本株相比有所降低,表明tu-f A基因编码的延伸因子(EF-Tu)在调控细菌侵袭细胞的过程中起着一定的作用。本研究通过构建tu-fA基因缺失的S.enterica株,为进一步研究tu-fA基因编码的EF-Tu的功能奠定基础。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2015,(6)
为构建以新城疫病毒(NDV)为活病毒载体表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)g B主要抗原表位区域的重组病毒,本研究以ILTV LJS09株的DNA为模板,通过PCR技术扩增1 323 bp ILTV编码g B主要抗原表位的基因片段(1 bp~440 bp),将其插入到NDV感染性克隆p BR-FL中,构建含有ILTV g B主要抗原基因的NDV c DNA克隆p BR-FL-g B1-440。利用磷酸钙转染法,在辅助质粒p CI-neo-NP、p CI-neo-P和p CI-neo-L的共同作用下,将重组质粒转染于表达T7聚合酶重组痘病毒预感染的BSR-T7/5细胞,获得重组病毒r L-g B1-440。采用RT-PCR检测接种重组病毒的鸡胚尿囊液,结果表明重组病毒中含有相应的外源基因。利用g B的抗血清检测重组病毒中g B的表达,间接免疫荧光试验表明,在感染重组病毒的BSR-T7/5细胞中目的蛋白得到表达。本研究为研制和开发传染性喉气管炎重组新城疫二联活疫苗奠定基础。 相似文献
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用患病雏番鸭肝脏和胰脏病料接种易感番鸭胚分离到一株病毒,经鉴定为细小病毒科、细小病毒属、番鸭细小病毒。本毒株首先在番鸭胚传3代适应后,转在鹅胚传38代,使12日龄鹅胚的致死时间稳定在第5～9天,致死率约98％,毒价ELD_(50)可达10~(6～7/0.2ml;M_(91)G_(26)鹅胚绒尿液接种1日龄易感雏番鸭已不引起发病,接种后20天,血清中琼扩抗体均为阳性。 相似文献
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鸡新城疫病毒(NDV)V_4株是澳大利亚学者自健康鸡体内分离获得的自然无毒株.自1988年以来,我们对其特性进行了较为系统的鉴定,结果发现,V_4株病毒可以在鸡胚中很好地增殖,感染鸡胚的尿囊液对鸡红细胞的血凝效价可达1:320～1:1280,这种血凝作用能为已知的NDV阳性血清所抑制,也能凝集人的O型红细胞,但不凝集猪、马等动物的红细胞,对发育鸡胚不致死,但鸡胚半数感染量(EID_(50))可达10~(-8.0)～10~(-9.0)/0.1mL;56℃1h仍然保留感染性,通过耐热筛选,获得 相似文献
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《中国预防兽医学报》2020,(6)
为了解H5N3亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对从我国广西省鸭体内分离到的一株低致病力H5N3亚型AIV DK/GX/S11453/2019(H5N3)进行了全基因组序列分析、抗原性分析、对小鼠的感染性以及受体结合特性分析。全基因组序列分析显示,该病毒的基因具有明显的野鸟源性,该病毒除HA与NA来源相同外,其余片段均来源不同,具有明显的遗传多样性。HA蛋白的裂解位点仅含有一个碱性氨基酸,符合低致病力AIV的分子特征。抗原性分析结果显示该病毒分离株与近几年国内使用的各疫苗株的抗原差异性较大。小鼠感染性试验结果显示,该病毒对小鼠呈现低致病力,不引起小鼠明显的体质量下降,但可以在小鼠的肺脏和鼻甲内有效的复制。受体结合特性分析结果显示,该病毒具有同时结合α-2, 3和α-2, 6受体的能力,存在一定感染哺乳动物的风险。本研究通过对该H5N3亚型AIV部分生物学特性的分析,为H5N3亚型禽流感的防控提供理论依据。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2016,(5)
为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)5′端非病毒核苷酸对感染性克隆拯救的影响,优化PRRSV反向遗传操作平台,本试验构建了含有CMV启动子的PRRSV JXA1-R株全长克隆质粒,在CMV启动子的下游引入锤头核酶序列,并在PRRSV基因组的5′端上游和锤头核酶下游之间引入非病毒核苷酸,分别构建成5′端含有非病毒核苷酸GG和GCTAGC的PRRSV全长感染性cDNA克隆Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV。新构建的两株克隆质粒直接转染BHK-21细胞拯救,48h后用间接免疫荧光检测病毒M蛋白,结果表明两株克隆均可拯救成活,测定Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV转染上清的病毒毒价分别为3.0和1.25TCID50/mL,拯救病毒在Marc-145细胞上传3代后均稳定在6.5TCID50/mL,病毒滴度无明显差异。本研究成功构建了两株5′端上游含有非病毒核苷酸的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆,表明PRRSV的5′端上游含有两个非病毒核苷酸GG拯救效率较高,且5′端的病毒外源核苷酸对拯救的影响仅存在于拯救的最初阶段。 相似文献
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为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)5'端非病毒核苷酸对感染性克隆拯救的影响,优化PRRSV反向遗传操作平台,本试验构建了含有CMV启动子的PRRSVJXA1-R株全长克隆质粒,在CMV启动子的下游引入锤头核酶序列,并在PRRSV基因组的5'端上游和锤头核酶下游之间引入非病毒核苷酸,分别构建成5'端含有非病毒核苷酸GG和GCTAGC的PRRSV全长感染性cDNA克隆Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV。新构建的两株克隆质粒直接转染BHK-21细胞拯救,48h后用间接免疫荧光检测病毒M蛋白,结果表明两株克隆均可拯救成活,测定Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV转染上清的病毒毒价分别为3.0和1.25TCID50/mL,拯救病毒在Marc-145细胞上传3代后均稳定在6.5TCID50/mL,病毒滴度无明显差异。本研究成功构建了两株5'端上游含有非病毒核苷酸的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆,表明PRRSV的5'端上游含有两个非病毒核苷酸GG拯救效率较高,且5'端的病毒外源核苷酸对拯救的影响仅存在于拯救的最初阶段。 相似文献
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从鸭体、禽胚和细胞 3个方面探讨了雏半番鸭呼肠孤病毒 FZ2 株的致病性。经试验表明 ,在实验室条件下 ,该株病毒可导致雏番鸭、雏半番鸭发病、死亡 ,对雏番鸭的致死率为 14 .3%～ 4 1.7% ,对雏半番鸭的致死率高达 38.5 % ,且死亡鸭表现出与自然感染呼肠孤病毒病死的雏番鸭、雏半番鸭相同的病变 ;人工感染幸存鸭大多生长发育明显受阻。该株病毒经尿囊腔途径接种 ,对番鸭胚、半番鸭胚、北京鸭胚、SPF鸡胚的致死率分别为 10 0 %、96 %、2 8%和 0 ,致死鸭胚的肝脏、脾脏表面见白色坏死点。经蛋传试验表明 ,该株病毒有可能经胚蛋垂直传染。以该株病毒在番鸭胚成纤维细胞 (MDEF)上连续传接 10代 ,结果细胞病变 (CPE)仍不明显 ,表明其不易适应 MDEF。由此可见 ,该株雏半番鸭源呼肠孤病毒具有较强的致病力 相似文献
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为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白第200位N-糖基化位点的功能,利用流感病毒8质粒反向遗传系统拯救出重组病毒r-WZP株(缺失HA基因第200位N-糖基化位点)和r-WZP200株(含有HA基因第200位N-糖基化位点)。两株病毒的内部基因来自病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1),HA基因与NA基因均来自H9N2AIV流行毒株。结果表明,两株病毒均能够在SPF鸡胚中稳定增殖,这一位点的缺失致使病毒与鸡红细胞的结合能力下降,HA效价热稳定性提高,对SPF鸡胚的致死能力增强,对进一步研究H9N2亚型AIV HA蛋白N-糖基化位点的功能具有重要的参考价值。 相似文献
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《畜牧与兽医》2020,(4)
为了拯救具有感染性的髓细胞瘤型J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)HB2015029株,本研究以含有ALV-J HB2015029株基因组片段的质粒为模板,采用高保真PCR,扩增出3段重叠并含有合适酶切位点病毒基因片段。将获得的基因组片段分别克隆至pTopo-Blunt Simple载体,经过酶切、连接成功构建了含有病毒全基因组的质粒TOPO-029-ABC。将TOPO-029-ABC质粒转染进DF-1细胞进行病毒拯救,结果表明,转染72 h后的细胞上清禽白血病病毒P27抗原呈阳性;将阳性细胞上清,接种新的DF-1细胞培养3 d,P27抗原ELISA检测、特异性PCR和间接免疫荧光试验均呈阳性,表明成功构建了ALV-J HB2015029感染性克隆,并拯救具有感染性的髓细胞瘤型ALV-J,命名为rHB2015029。 相似文献
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为构建缺失马立克氏病病毒(Mareks disease virus,MDV)Meq基因簇microRNAs(Meq-clustered miRNAs的突变株,本研究在vv MDV GX0101细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)克隆的基础上,采用Red/ET同源重组技术将Meq-clustered miRNAs的编码基因进行缺失突变,经PCR鉴定及序列分析证明Meq-cluster miRNAs序列成功缺失后,提取Δmeq-miRNAs BAC DNA,转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行病毒拯救,用SYBR GreenⅠqRT-PCR检测病毒体外增殖特性。结果表明成功拯救出缺失MDV Meq-clustered miRNAs基因的感染性BAC克隆株GX0101Δmeq-miRNAs,且该缺失株与亲本株GX0101BAC具有相似的增殖曲线,Meq-clustered miRNAs是MDV体外复制的非必需基因。MDV Meq-clustered miRNAs基因缺失感染性BAC克隆株的成功构建为进一步研究MDV Meq-clustered miRNAs在MDV致病和致肿瘤方面的作用奠定了基础。 相似文献