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1.
为构建表达猪白细胞介素2(IL-2)的复制缺陷型重组腺病毒,本研究提取经刀豆球蛋白A(con A)刺激体外培养的长白猪外周血淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR扩增猪IL-2基因,并克隆于质粒pIRES2-EGFP中,将含有IL-2及EGFP的基因片段亚克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315中,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-IL-2-EGFP.利用脂质体转染方法将pDC315-IL-2-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔEl,E3Cre共转染HEK293细胞.根据腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP的荧光信号筛选重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP.经western blot鉴定,结果表明获得了一株能够表达猪IL-2蛋白的重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP.本研究为进一步研究猪IL-2在疫苗免疫中的增强作用及研制新型免疫增强剂奠定了基础. 相似文献
2.
《中国兽医学报》2015,(9):1422-1428
为了获得表达猪细小病毒(PPV)VP2蛋白和细胞因子猪白细胞介素-18(IL-18)的重组猪伪狂犬病毒(PRV)。将PPV VP2基因和猪IL-18基因分别插入到PRV转移质粒PG中,得到重组质粒PG18-VP2。利用脂质体转染法将重组转移质粒PG18-VP2与猪PRV弱毒株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,以EGFP荧光标记,通过5轮蚀斑筛选纯化,成功获得表达PPV VP2蛋白和猪IL-18且带EGFP标记的重组伪狂犬病毒IL18-VP2-rPRV。用重组病毒感染ST细胞,12h后在荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光;通过RT-PCR证实感染细胞中含有PPV VP2和猪IL-18mRNA;Western-blot试验结果显示,重组病毒能表达具有生物活性的PPV VP2蛋白和猪IL-18。重组病毒经连续20次传代后感染细胞仍能发出绿色荧光,PCR检测表明VP2及IL-18基因在重组病毒中能稳定遗传。为进一步研究表达PPV VP2蛋白和猪IL-18的重组猪伪狂犬病毒的免疫效力奠定了基础。 相似文献
3.
以含猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增猪IL-2成熟蛋白基因。将猪IL-2成熟蛋白基因定向克隆到杆状病毒转移载体pFastBac Dual中,转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性及蓝白斑筛选得到含猪IL-2基因的重组质粒rBacmid-IL2,转染昆虫细胞。间接免疫荧光试验表明重组猪IL-2在Sf9昆虫细胞中获得了表达,SDS-PAGE可检测到相对分子质量为20000的重组蛋白,Western-blot证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应,重组猪IL-2经纯化后能明显促进猪T淋巴细胞转化。结果表明,重组猪IL-2在昆虫细胞中得到表达,表达的重组蛋白具有一定生物学活性,为进一步开发研制新型免疫佐剂奠定了基础。 相似文献
4.
《畜牧兽医学报》2020,(3)
为了初步探讨绵羊痒螨巨噬细胞迁移抑制因子(PoMIF)对健康新西兰兔外周血单个核细胞(PBMC)中Th1/Th2和Th17/Treg细胞平衡的变化。采用RT-PCR从绵羊痒螨总RNA中扩增得到MIF全长基因,经原核表达、纯化重组PoMIF(rPoMIF)蛋白,并分析其氧化还原酶和互变异构酶活性。筛选与健康新西兰兔PBMC孵育的最佳rPoMIF浓度,且用最佳浓度rPoMIF(0.2μg·mL~(-1))与PBMC共同孵育0、1、6、12、24、36 h后收集细胞,用荧光定量PCR检测其Th1/Th2/Th17/Treg细胞相对应的特征性转录因子T-bet/GATA-3/RORc/Foxp3和特征性细胞因子IFN-γ/IL-4/IL-17A/IL-10 mRNA表达变化。结果表明:PoMIF全长363 bp,rPoMIF大小为32 ku(含pET32a标签蛋白19 ku),且具有互变异构酶活性;rPoMIF刺激后PBMC中Th1细胞的T-bet和IFN-γ先下降后上升,Th2细胞的GATA-3和IL-4均呈下降趋势,且T-bet/GATA-3和IFN-γ/IL-4比值在12、24和36 h均升高;Th17细胞的RORc和IL-17A在各时间点下降,而Treg细胞的Foxp3和IL-10在各时间点升高,且RORc/Foxp3和IL-17A/IL-10比值在各时间点均变低。rPoMIF可造成家兔外周血单个核细胞的Th1/Th2和Th17/Treg平衡分别向Th1和Treg偏移。 相似文献
5.
猪IL-2基因的克隆、序列分析及其杆状病毒表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
参照GenBank发表的猪IL-2 cDNA基因序列设计1对引物,将猪脾淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下体外培养27 h后,提取激活淋巴细胞总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,克隆到pGEM-TEasy载体上并测序.测序结果显示,克隆的猪IL-2 cDNA全长为516 bp,开放阅读框(ORF)包含465 bp,编码154个氨基酸,相对分子质量为17 400,等电点为5.27,此cDNA与已报道的猪IL-2同源性为100%.与猫、牛、鸡、犬、鸭、山羊、马、人、家鼠等的IL-2基因进行比较分析,核苷酸同源性分别为83.7%、82.6%、28.2%、80.6%、29.6%、83.4%、81.3%、82.0%和61.5%.将此IL-2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual后获得了重组质粒pFBD-IL2,进而转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用;经抗性及蓝白斑筛选得到了含猪IL-2基因的重组DNA,将其命名为Bacmid-IL2.本试验为进一步在昆虫细胞中表达猪IL-2基因、开发研制新型免疫佐剂奠定了基础. 相似文献
6.
为探索猪α干扰素（poIFN-α）与白介素-18（poIL-18）融合基因的抗病毒效果,本研究通过融合PCR,以质粒pMD18-T/poIFN-α和pMD18-T/poIL-18为模板扩增猪IFNα-IL18（poIFNα-IL18）融合基因。将poIFNα-IL18融合基因插入原核表达载体pET-28b（+）构建重组表达质粒pET-28b/poIFNα-IL18,转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组表达蛋白;经镍琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化后,用微量细胞病变抑制法在PK-15/VSV系统上进行抗病毒活性测定。结果表明成功构建重组表达质粒pET-28b/poIFNα-IL18;SDS-PAGE可检测到分子质量为37 ku左右的蛋白条带,与目的蛋白大小相近;经镍琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化,获得高纯度重组蛋白;用微量细胞病变抑制法在PK-15/VSV系统上检测到重组蛋白poIFNα-IL18比单一蛋白poIFN-α和poIL-18的抗病毒活性显著,其抗水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV)活性分别为1.03×105、1.28×104及0.11×104 U/mg。 相似文献
7.
通过研究重组白细胞介素-2（IL-2）对口蹄疫病毒（FMDV）多表位疫苗免疫效果的增强作用,为IL-2作为 FMDV 表位疫苗佐剂应用提供实验依据。6周龄雌性 Balb／c 小鼠,分为4组,第1组联合免疫表达猪 IL-2的重组腺病毒（rAd5poIL-2）和串联表达 FMDV 多表位基因的重组腺病毒（rAd5EGS）,第2、3和4组分别注射 rAd5EGS、灭活疫苗和 PBS,间隔2周免疫1次,共免疫3次。首免后每周采血分离小鼠血清,通过 ELISA 检测血清中特异性 IgG;首免后6周检测血清中抗体亚型 IgG1、IgG2a 及细胞因子 IL-4和 IFN-γ的表达水平,同时分离脾细胞,MTT 法检测淋巴细胞增殖指数。结果显示,联合免疫 rAd5poIL-2和rAd5EGS 既能增强 rAd5EGS 诱导小鼠特异性 IgG、IgG1和 IgG2a 的分泌,又能增强其诱导淋巴细胞增殖能力,且免疫效果强于灭活疫苗;细胞因子检测结果显示,联合免疫 rAd5poIL-2后能增强 rAd5EGS 诱导小鼠 IL-4和 IFN-γ的分泌,且其诱导 IL-4和 IFN-γ分泌能力也强于灭活疫苗。说明重组 IL-2能有效增强FMDV 多表位疫苗诱导抗体分泌能力和细胞免疫应答,rAd5poIL-2有望作为 FMDV 表位疫苗的候选佐剂。 相似文献
8.
将克隆的梅山猪LH-β基因亚克隆到真核表达型载体VR1020上，通过质粒PCR的方法在转化子中筛选阳性克隆，用BamH I、BglⅡ双酶切鉴定重组子。得到的重组真核表达质粒转染Cos7细胞株，RT—PCR检测猪LH—β表达情况。然后用VPLH—β质粒、VR1020分别肌肉注射小鼠，研究了小鼠的生殖特性情况。结果显示：通过质粒PCR和双酶切分析，得到猪LH—p基因以正确方向插入的重组真核表达质粒VPLH—β。重组质粒VPLH—β经脂质体介导转染Cos7细胞，培养不同时间后提取mRNA进行RT—PCR，发现转染细胞RNA中含有与LH—β基因对应的mRNA；结果表明已成功构建了PLH—β的真核表达质粒，能正确转录表达LH—β。动物试验结果显示PLH—β免疫小鼠后的各项指标均高于对照处理。克隆构建的猪VPLH—β质粒能发挥明显的生殖生理调节作用，可较好地促进雌性动物的排卵、怀孕和正常产仔。 相似文献
9.
猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 总被引：14，自引：0，他引：14
通过RT—PCR方法从用PHA和LPS刺激的猪脾脏细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，克隆到T载体pUCm-T后，序列测定表明，pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474bp，编码157个氨基酸。将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a构建重组质粒pETIL18m，转化大肠杆菌BL21(DE3)，并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS—PAGE可检测到相对分子质量为19000的重组蛋白，免疫印迹法证实该重组蛋白可以与人IL-18单抗发生特异性免疫反应。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2015,(4):530-535
为了构建共表达猪圆环病毒2型(PCV2)CAP蛋白和猪IL-18的重组禽痘病毒,本研究将CAP基因和猪IL-18基因分别置于pSY538的痘病毒启动子LP2EP2下,然后插入到含有痘苗病毒启动子P11启动的LacZ基因的禽痘病毒转移载体pSY681/lacZ中,获得重组转移质粒pSY681/CAP/IL18。将重组质粒pSY681/CAP/IL18转染入鸡胚成纤维细胞内,使CAP基因、猪IL-18基因和LacZ基因同源重组到禽痘病毒S-FPV-017中,产生重组禽痘病毒,经多次蓝斑克隆筛选纯化后,最终得到共表达CAP蛋白和猪IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-CAP/IL18)。以rFPVCAP/IL18感染CEF,通过RT-PCR检测,CEF细胞中含CAP基因和猪IL-18基因的mRNA,间接免疫荧光试验证实感染rFPV-CAP/IL18的CEF能表达CAP蛋白。重组禽痘病毒能表达具有生物学活性的CAP和猪IL-18,为进一步的免疫效力研究奠定了基础。 相似文献
11.
12.
通过克隆、表达海南原鸡程序性细胞死亡分子10(Programmed cell death10,PDCD10)基因,对其蛋白进行生物信息学分析。采用RT-PCR方法克隆得到海南原鸡PDCD10基因CDS区,将扩增产物与原核表达载体pET42a连接,构建pET42a-PDCD10重组质粒,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot分析;运用生物信息学软件对所获得基因的核苷酸序列进行分析,并预测其编码蛋白的理化性质及二级结构等。克隆获得了PDCD10639bp的CDS区核苷酸序列,融合蛋白分子量约为57ku,生物信息学分析发现,PDCD10CDS区包括1个639bp的开放读码框,编码212个氨基酸。该蛋白不含信号肽,无跨膜区,二级结构中存在大量α-螺旋。研究结果为进一步开展海南原鸡PDCD10的功能研究奠定了坚实的基础。 相似文献
13.
不同黄芩成分对孕鼠免疫功能的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
怀孕5～7d小鼠皮下注射0．075mg溴隐亭建立流产模型，于怀孕1～7d分别灌服蒸馏水、黄芩煎剂、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素，至怀孕10d宰杀。结果显示，血清中IFN-γ含量，以黄芩煎剂组为最低，子宫匀浆中IFN-γ含量，以黄芩苷组为最低，与对照组比较差异极显著（P〈0．01）；孕酮含量在血清及子宫匀浆中均以黄芩苷组为最高，与对照组差异显著（P〈0．05），各组间IL-10含量差异不显著。这一结果表明，黄芩成分对母体免疫功能有一定调节作用，其中黄芩苷可降低Th1型细胞因子含量，提高孕酮的含量，具有一定的保胎作用。 相似文献
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鸭β-防御素10基因的克隆、遗传进化分析及其生物学特性的初步研究 总被引：3，自引：0，他引：3
旨在从鸭肝脏组织中克隆鸭β-防御素10(AvBD10)基因,并在原核表达重组鸭AvBD10蛋白,研究重组鸭AvBD10蛋白的体外抗菌活性与理化特性.试验采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD10基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD10基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD10,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达;亲和层析纯化蛋白,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定重组鸭AvBD10蛋白的体外抗菌活性与理化特性.结果表明,鸭AvBD10 cDNA大小为169bp,编码55个氨基酸残基,与鸡AvBD10氨基酸同源性为85.5%.该基因仅在不同日龄鸭肝脏与肾脏组织中大量表达.重组鸭AvBD10融合蛋白的分子量约为30 ku,重组蛋白占菌体总蛋白的34%.重组鸭AvBD10蛋白对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抗菌活性.结果,从鸭肝脏组织中扩增了鸭AvBD10基因,该基因仅在不同日龄鸭肝脏与肾脏组织中大量表达.重组鸭AvBD10融合蛋白具有广谱抗菌活性,该重组蛋白对温度和酸碱度有很高的稳定性. 相似文献
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本试验旨在研究黄芩苷的促孕保胎作用及其对母胎界面细胞因子的影响。取怀孕小鼠分成5组,除对照组外,其它4组于孕5-7天皮下注射溴隐亭建立流产模型,孕1-7天分别灌服蒸馏水、0.1、0.51、mg黄芩苷。孕3、5、7、10、12天采样,计算流产率,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清及子宫匀浆中干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-10(IL-10)、孕酮的含量。结果孕12天时1 mg黄芩苷组流产率降低,接近对照组,与模型组均有显著差异。孕5天各组血清和子宫匀浆中IFN-γ含量显著上升,其中1 mg黄芩苷组最高。孕酮含量随孕期延长而提高,以0.5和1 mg黄芩苷组最高。表明黄芩苷可剂量依赖性上调孕酮的含量,促进着床期IFN-γ分泌,胚泡附植后又降低IFN-γ的含量,调节着床和妊娠期Th1/Th2细胞因子平衡,影响内分泌-免疫网络,有利于胚胎着床和妊娠维持。 相似文献
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Stephen T. Sinatra Raj K. Chopra Stanley Jankowitz David W. Horohov Hemmi N. Bhagavan 《Journal of Equine Veterinary Science》2013
Although the importance of coenzyme Q10 (CoQ10) in health and disease and its critical role in cellular bioenergetics have been well established in various species, there is a total lack of information on the role of CoQ10 in horses. Therefore, the present study was undertaken first to ascertain the occurrence of CoQ10 and/or possibly other homologs of coenzyme Q (CoQ) in horse serum, and then to examine the response to CoQ10 supplementation on serum CoQ10 concentration. The study was carried out with 2-year-old Thoroughbred horses. Total CoQ (reduced and oxidized forms) in serum was assayed by high-performance liquid chromatography. The data show that horse serum contains CoQ as CoQ10, at a much lower concentration as compared with that of humans and several other species. There is no evidence for the presence of coenzyme Q9 or other homologs of CoQ. On supplementation with CoQ10 at 800 mg a day (1.47 mg/kg body weight), there was a significant increase in serum CoQ10 concentration, approximately 2.7-fold at 60 days. CoQ10 supplementation at this dosage was found to be safe and well tolerated. Additional studies are needed to examine whether maintaining higher serum CoQ10 concentrations is of potential health benefit to the horses, as assessed by selected biochemical markers and also in terms of performance. 相似文献
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Stephen T. Sinatra Stanley N. Jankowitz Raj K. Chopra Hemmi N. Bhagavan 《Journal of Equine Veterinary Science》2014
The fundamental role of coenzyme Q10 (CoQ10) in cellular bioenergetics is well established in humans and several other species, yet there is no information about its role in horses. In continuation of our study of serum CoQ10 in Thoroughbred race horses, we examined the effect of CoQ10 supplementation and exercise on changes in plasma CoQ10 and α- and γ-tocopherol concentrations. Two groups of horses, five per group, were used. One group received 1.9 g of CoQ10 daily and the second group 3.4 g as a dietary supplement. Both groups were subjected to graduated training sessions that involved low-intensity exercise (gallop) followed by high-intensity exercise (breeze). CoQ10 supplementation resulted in a significant increase in plasma CoQ10 during low-intensity exercise, whereas the increase following high-intensity exercise was markedly attenuated in both groups (P < .05). There were no changes in plasma α- and γ-tocopherol concentrations following the two exercise sessions. γ-Tocopherol constituted approximately 5% of α-tocopherol; this is the first report of plasma γ-tocopherol in horses. The attenuated response of plasma CoQ10 in horses receiving CoQ10 supplementation following high-intensity exercise may be attributed to its consumption during severe oxidative stress. This finding indicates that in horses not receiving any CoQ10 supplementation, high-intensity exercise would result in a marked depletion of endogenous CoQ10 in plasma, which could compromise their health and physical performance. This documents the importance of CoQ10 in horses. The study also establishes the safety and tolerability of high-dose CoQ10 in Thoroughbred race horses. 相似文献