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湖南省牛无浆体虫株分子生物学鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
用原虫16 S rRNA基因序列通用引物对湖南5个地区牛无浆体感染的阳性血液样品进行PCR扩增,经测序和序列拼接,获得5个无浆体样品16 S rRNA基因的部分序列,应用分子生物学软件进行分析,并根据所获得序列的保守区间设计特异性引物,进行PCR诊断方法的探讨性研究.结果表明,在通用引物下,5个地区无浆体感染的阳性血液样品均获得1 425 bp大小的虫体16 S rRNA基因条带;测序后5个无浆体16 S rRNA序列同源性均在97%～98%.证明5个分离虫株初步鉴定为牛边缘无浆体. 相似文献
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为建立一种能快速对羊泰勒虫（ovine and caprine theileria）和嗜吞噬细胞无浆体（A. phagocytoph-ilum）同时进行检测的双重PCR方法。根据GenBank已报道的羊泰勒虫MPSP基因和羊嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因设计合成了2对特异性引物,通过条件优化,建立了双重PCR检测方法。双重PCR可特异扩增出羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体目的条带,片段大小分别为875bp和394bp。该方法具有较好的特异性,对羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体的最低检出浓度为16fg/μL和1fg/μL。对采集的60份血液样本进行双重PCR检测,羊泰勒虫阳性率为46.67%(28/60),嗜吞噬细胞无浆体阳性率为13.33%(8/60),混合感染率为10%(6/60)。结果表明,双重PCR方法可用于羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体的快速诊断和流行病学调查。 相似文献
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从自然感染无浆体的重庆黄牛无菌采集血液,提取全血基因组,用血营养菌16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增,得到长约1500 bp的扩增片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行测序,并与5条边缘无浆体、4条中央无浆体、4条牛无浆体、4条羊无浆体和3条嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因序列进行系统发育分析.结果表明所克隆的基因片段长度为1412 bp,GenBank登录号为FJ169957.序列比较结果显示,所获得的序列与Kawa-hara公布的牛无浆体日本株(AB211163)同源性最高,达到99.0%,系统发育分析发现,该序列被聚类到牛无浆体群,并与嗜吞噬细胞无浆体群聚类到一个大的分支.本文从分子水平证实重庆地区存在牛无浆体,牛无浆体与嗜吞噬细胞无浆体的亲缘关系比其他3种无浆体更近. 相似文献
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新疆牛环形泰勒虫Tams1基因的克隆与表达 总被引：3，自引：0，他引：3
采用PCR方法扩增环形泰勒虫Tams1基因,将扩增产物与pUcm-T载体连接,重组质粒经PCR和双酶切鉴定、测序确认后被亚克隆于pGEX-4T-2表达载体中.构建的表达重组质粒经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析.结果显示,克隆的Tams1基因片段长846 bp,为一个完整的开放阅读框,编码281个氨基酸,与GenBank中的Tams1基因核苷酸同源性在93.6%～99.8%之间;系统进化树分析表明新疆分离株与印度株、毛利塔尼亚株和北非共和国株进化途径一致,与苏丹株、巴林株进化途径相差较远;推测的蛋白质抗原决定簇预测表明,Tams1基因编码的氨基酸具有13个交叉的抗原决定簇;表达的融合蛋白为56 ku,能够被环形泰勒虫多克隆血清所识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为进一步开展牛环形泰勒虫的分子生物学诊断、亚单位疫苗和核酸疫苗的研究奠定了可靠的基础. 相似文献
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《新疆畜牧业》2021,(5)
为对吐鲁番地区璃眼蜱的精确鉴定提供依据,同时为该蜱分类以及携带病原溯源奠定基础。本研究对采集的疑似患牛体表璃眼蜱(n=120)采用形态学和ITS2基因特异性PCR方法鉴定出其种,再通过Tams1基因特异性PCR方法鉴定出其携带病原情况。结果显示,经形态学鉴定均为小亚璃眼蜱,PCR结果显示扩增的璃眼蜱ITS2基因和环形泰勒虫Tams1基因序列分别与Gen Bank中已记载的小亚璃眼蜱ITS-2、环形泰勒虫Tams1基因序列一致。在检测的120枚璃眼蜱中,携带牛环形泰勒虫病原的有11只,阳性率为9.17%(11/120)。结果表明,在传统形态学分类的基础上,借助分子生物学方法对璃眼蜱种属鉴定及无典型硬蜱种的鉴定不但具有简易、准确度高等特点,而且在璃眼蜱种属确定的基础上分离其携带的病原更有实际意义。 相似文献
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牛泰勒虫18S rRNA基因序列比较研究 总被引：4，自引：0，他引：4
作者对中国兽医微生物菌种保藏中心原虫资源库内收藏的3种牛源泰勒虫10个地方分离株(包括4株环.形泰勒虫、3株瑟氏泰勒虫和3株中华泰勒虫)的18S rRNA基因序列进行了测定,并用所测得的牛的泰勒虫中国株基因序列和自GenBank下载的各种泰勒虫18S rRNA基因序列构建了系统发生树.结果显示;牛的3种泰勒虫18S rRNA基因大小在1 740～1890 bp,并有规律地分布于3个不同的进化枝上,且种内地方分离株之间的同源性明显大于种间同源性,说明采用18S rRNA基因序列测定方法对牛的泰勒虫进行分类与传统分类方法具有较好的符合性.该研究也可为建立针对18S rRNA基因为靶标的牛的泰勒虫病PCR检测方法奠定基础. 相似文献
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为了建立马梨形虫病双重PCR检测方法,试验根据Gen Bank发表的驽巴贝斯虫和马泰勒虫18S rRNA保守基因序列分别合成2对特异性引物,以核酸混合物为模板,优化反应条件建立马梨形虫病双重PCR检测方法,并检验该方法的特异性和敏感性。同时用该双重PCR检测方法对采自昭苏种马场的马疑似病例全血进行检测,并与镜检法和单重PCR法进行比较。结果表明:该双重PCR检测方法能对驽巴贝斯虫和马泰勒虫核酸扩增出大小为529 bp和789 bp特异性目的片段,而对双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、羊泰勒虫、牛巴贝斯虫核酸的扩增均为阴性;驽巴贝斯虫和马泰勒虫阳性DNA被稀释1×108倍时均能检出其相应目的片段;对采集的46份马疑似病例血样进行PCR诊断,其中驽巴贝斯虫感染率为30.4%(14/46),马泰勒虫感染率为41.3%(19/46);双重PCR检测方法与单重PCR方法的符合率为100%。说明建立的双重PCR检测方法具有一定的特异性和敏感性,可用于驽巴贝斯虫和马泰勒虫临床感染隐性病例的联合检测与鉴别诊断。 相似文献
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为寻求一种快速灵敏的环形泰勒虫病PCR检测方法,基于环形泰勒虫裂殖体表面蛋白（Theirelia annulata surface protein,TaSP）基因序列保守区设计特异性引物,通过PCR技术扩增出该基因长为393 bp的高免疫原性区片段。用该引物对环形泰勒虫、中华泰勒虫、瑟式泰勒虫、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、马泰勒虫、驽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫基因组模板进行特异性试验,对环形泰勒虫基因组模板进行梯度稀释后扩增,以确定试验的敏感性,同时用本试验建立的方法与常规显微镜镜检方法对150份血清样品进行检测。特异性试验结果显示,在被检测的9个样本中,只有环形泰勒虫基因组模板中扩增出了符合大小的特异核苷酸片段;敏感性试验结果表明,PCR对环形泰勒虫的扩增效率可达到10-10;通过对150份血清样品的检测,并与血涂片方法进行比较,结果显示PCR方法具有特异性强、敏感度高等特点,适用于牛环形泰勒虫病的检测。 相似文献
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《中国兽医学报》2015,(12)
通过对璃眼蜱形态学及璃眼蜱属特异性基因(ITS-2)和其携带病原基因(Tams1)PCR扩增及其PCR产物的克隆、测序、同源性比较等,鉴定和检测采自新疆吐鲁番地区疑似牛体表璃眼蜱(n=50)及其携带病原状况。结果显示,采集的蜱虫经形态学鉴定均为小亚璃眼蜱,PCR扩增的璃眼蜱种属特异性ITS-2基因和环形泰勒虫Tams1基因序列大小分别为491 bp和534 bp。本试验获得的ITS-2序列与Gen Bank中已记载的小亚璃眼蜱ITS-2序列一致,与形态学鉴定结果相符,故这些璃眼蜱属于小亚璃眼蜱种(Hyalomma anatolicum)。在检测的50只璃眼蜱中,携带牛环形泰勒虫的有3只,阳性率为6%(3/50),并发现所扩增的携带病原目的基因序列与已登录记载的牛环形泰勒虫基因序列相似性为99%。结果表明,在传统形态学分类的基础上,借助分子生物学方法对璃眼蜱种属鉴定及无典型硬蜱种的鉴定具有简易、准确度高等特点,而且在璃眼蜱种属确定的基础上分离其携带的病原更有实际意义。 相似文献
12.
为建立荧光定量PCR方法检测嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum),针对GenBank A.phagocytophilum 16S rRNA基因保守序列(JN558815),设计1对引物1-25F/183-205R。以已知引物EE1/EE2和该引物进行巢式PCR扩增出预期大小片段(205bp),构建含有16S rRNA基因的重组质粒,以质粒为模板构建了标准曲线。以1-25F/183-205R为荧光定量PCR引物,建立A.phagocytophilum荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验和临床样本检测。结果表明,该方法在6.4×10~3~6.4×10~8 copies/μL相关系数为0.99,显示出良好的线性关系;所建方法能特异地检出A.phagocytophilum,对绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫基因组DNA和灭菌双蒸水均无交叉反应;可检测到6.4×10~2 copies/μL的标准质粒DNA,比常规PCR敏感性高100倍;批内及批间变异系数均低于2.0%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法对30份羊血液临床样品检出率比巢式PCR高16.67%。该研究为A.phagocytophilum临床检测和定量分析病原感染程度奠定理论基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2014,(8):1261-1266
利用THB(Todd-Hewitt Broth)固体培养基和色素试验培养基选择培养无乳链球菌,参照GenBank中无乳链球菌参考菌株(Accession:AF015927.1、JQ289582.1)16SrRNA和种属特异性基因cfb(CAMP因子)序列设计引物,对奶样中分离的12株疑似无乳链球菌进行鉴定。结果显示,经PCR扩增后,被检测的12株细菌均可扩增出预期大小的16S rRNA基因序列,而12株中有8株可以扩增出预期大小的cfb基因序列,条带单一,特异性好。序列BLAST显示,12株菌的16S rRNA基因序列与NCBI上报道的无乳链球菌相应序列高度同源(>99.0%),各分离菌株间的16S rRNA基因序列也高度同源(99.0%～100.0%);cfb基因序列与NCBI上已报道的无乳链球菌相应序列具有高度同源性(>99.0%),各菌株间cfb基因序列也高度同源(100.0%)。经选择培养与PCR鉴定结果可以确定12株疑似菌株中有8株为无乳链球菌。 相似文献
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本研究根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,对寄生于牛体内的瑟氏泰勒虫基因组DNA进行扩增,得到1 356 bp的18S rRNA基因片段,测序后blast分析表明该虫种属牛瑟氏泰勒虫。将该基因片段序列与GenBank中8种已知泰勒虫的相应序列进行比较分析,建立系统发育树。结果表明,牛瑟氏泰勒虫吉林分离株与水牛泰勒虫亲缘关系最近,与小泰勒虫亲缘关系较远。这一结果说明宿主因素对泰勒虫的基因型影响较大。 相似文献
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马泰勒虫病PCR检测方法的建立和应用 总被引：2，自引：1，他引：1
为寻求一种快速、有效的马泰勒虫 (Theileria equi,T.equi) PCR检测方法。基于马泰勒虫18S rRNA基因序列,在其V4高变区设计特异性引物Te-18F、Te-18R,通过PCR技术获得了531 bp的核酸片段。用该引物对马泰勒虫、马泰勒虫和驽巴贝斯虫混合样本、驽巴贝斯虫、尤氏泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫和瑟氏泰勒虫基因组模板进行特异性试验。同时对马泰勒虫基因组模板进行不同浓度稀释后扩增,以便于确定试验的敏感性。用本试验建立的方法与常规显微镜镜检方法对45份马属动物血样进行检测。特异性试验显示,在被检测的9个样本中,只有马泰勒虫及马泰勒虫和驽巴贝斯虫混合模板中扩增出了符合大小的特异核酸片段。驽巴贝斯虫、尤氏泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫和瑟氏泰勒虫的扩增结果均为阴性。灵敏度试验结果表明,PCR对马泰勒虫的扩增效率可达到10-13。对本试验建立的PCR检测马泰勒虫方法评估结果显示,PCR对马泰勒虫的检出率为17.78%(8/45),显微镜镜检结果只有8.89%(4/45)两者的符合率为100%。本试验建立的马泰勒虫PCR检测方法不失,为一种好的检测方法。 相似文献
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为了解南疆部分高山牦牛感染牛无浆体的情况,将2018年采集于巴音郭勒蒙古自治州哈尔诺尔牧场和喀什塔什库尔干塔吉克自治县的牦牛血样,以16S rRNA基因通用引物对提取的牦牛全血DNA进行PCR检测,并测序鉴定。结果显示,成功扩增了约1 500 bp左右的目的片段;哈尔诺尔牧场牦牛无浆体感染率为61.1%,塔什库尔干塔吉克自治县牦牛无浆体感染率为62.5%;阳性片段与基因库已记载的韩国牛无浆体相似性为98%,进化树分析显示与牛无浆体聚为一支。本研究为新疆高山牦牛无浆体病的防控提供依据。 相似文献
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羊泰勒虫PCR检测方法的建立和初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
利用羊泰勒虫18SrRNA基因的序列特点,设计合成种特异性引物,建立羊泰勒虫PCR检测方法,该方法能特异性扩增398bp的羊泰勒虫18SrRNA基因片段,而对羊巴贝斯虫、羊无浆体、牛环形泰勒虫和牛伊氏锥虫的基因组DNA没有扩增带出现。对羊泰勒虫基因组DNA的最小检测量为0.12fgDNA。通过检测124份临床样品,24份为羊泰勒虫感染阳性,其余为阴性。结果表明,建立的PCR检测方法具有极高的敏感性和特异性,可用于羊泰勒虫病和临床健康带虫羊的诊断。 相似文献
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为了建立梨形虫(Piroplasmida)和伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)的双重PCR检测方法，试验根据梨形虫的18S rRNA基因和伊氏锥虫的kDNA基因设计两对特异性引物，以吕氏泰勒虫和伊氏锥虫阳性样品DNA为模板进行单重PCR和双重PCR,并对双重PCR的退火温度进行优化，对本研究建立并优化的双重PCR方法进行特异性试验、敏感性试验及临床样品的检测。结果表明：本研究建立的双重PCR方法能够扩增出350 bp和600 bp的特异性目的条带，而无浆体、肝簇虫、弓形虫和埃立克体样品均呈阴性，梨形虫和伊氏锥虫最低检测浓度分别为54.70 fg/μL和14.30 fg/μL,用本试验建立的方法对临床样品的检测结果与对照方法(巢式PCR)检测结果一致。说明本研究成功建立了灵敏、快速、简便、特异性高的双重PCR检测方法，能够用于梨形虫和伊氏锥虫的临床检测及流行病学调查。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2019,(1)
为建立一种快速、敏感检测牛环形泰勒虫的方法,本研究根据GenBank中登录的牛环形泰勒虫Tams1基因序列,设计合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测牛环形泰勒虫SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,该方法可以特异地检测牛环形泰勒虫,而对牛巴贝斯虫、反刍动物艾立希体和弓形虫检测均为阴性;该方法的灵敏度可达到180拷贝/μL,比常规PCR敏感10倍;组内和组间变异系数均小于1.0%。对15份临床血液样品和20只璃眼蜱进行检测,SYBR Green I荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为42.86%和28.57%。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高的特点,可准确、高效检测牛环形泰勒虫,为牛环形泰勒虫病防控提供技术支持。 相似文献