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1.
鸡IL-18基因重组真核表达载体的构建及其表达产物的生物学活性 总被引：5，自引：0，他引：5
从pMDChIL-18克隆质粒扩增获得了ChIL-18全基因片段，并将其重组到真核表达载体pcDNA3．1( )。经酶切、质粒PCR鉴定和基因测序，鸡IL-18全基因被正确重组到pcDNA3．1( )真核表达质粒上；将重组真核表达质粒pcDNA3．1( )-ChIL-18转染COS-7细胞，转染细胞中含ChIL-18基因的mRNA。SDS-PAGE分析表明，表达产物是与ChIL-18相符的约23ku的蛋白条带。鸡淋巴细胞转化试验表明，表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。 相似文献
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为了找到一种获得鸡白细胞介素-18(IL-18)活性蛋白的简便方法,试验采用基因工程的方法,以鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆鸡IL-18成熟蛋白基因并进行序列分析。将鸡IL-18成熟蛋白基因克隆至原核表达载体pGEX-KG,构建原核表达质粒,通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组鸡IL-18蛋白在大肠杆菌中的表达,经葡聚糖凝胶层析柱纯化后,用3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测表达重组蛋白的生物学活性。结果表明:鸡IL-18成熟蛋白基因开放阅读框为510 bp,编码170个氨基酸;所获得的鸡IL-18成熟蛋白基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%;成功地构建了pGEX-IL-18原核表达质粒,表达的重组蛋白质量约为45.6 ku,该重组蛋白具有明显增强鸡脾淋巴细胞增殖的生物学活性。 相似文献
3.
为了研制新型细胞因子制剂，将鸡白细胞介素18（ChIL-18）基因和鸡α-干扰素（ChIFN-α）基因通过多肽氨基酸接头（Linker）连接在一起构成mChIL-18／mChIFN-α融合蛋白基因，并构建原核重组表达载体，以期表达具有生物学活性的融合蛋白。以mChIL-18 cDNA与mChIFN—αDNA为模板，通过PCR及PCR重叠延伸技术（SOE）得到mChIL-18／mChIFN-α融合DNA。将回收的DNA克隆于pGEM—TEasy载体，并对其进行了测序。测序结果表明获得了阅读框完整、连接部位正确的mChIL-18／mChIFN—α融合分子DNA。将所克隆的目的片断亚克隆到原核表达载体pQE30，构建重组质粒pQE30-mChIL-18／mChIFN-α。pQE30-mChIL-18／mChIFN—α的成功构建为研制开发新一代的多功能、多靶点的细胞因子制剂奠定了基础。 相似文献
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猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 总被引：14，自引：0，他引：14
通过RT—PCR方法从用PHA和LPS刺激的猪脾脏细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，克隆到T载体pUCm-T后，序列测定表明，pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474bp，编码157个氨基酸。将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a构建重组质粒pETIL18m，转化大肠杆菌BL21(DE3)，并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS—PAGE可检测到相对分子质量为19000的重组蛋白，免疫印迹法证实该重组蛋白可以与人IL-18单抗发生特异性免疫反应。 相似文献
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为了获取河南长白猪白细胞介素18(IL-18)基因的表达产物,试验从6月龄河南长白猪脾脏分离的淋巴细胞中提取总RNA,然后进行RT-PCR扩增,对扩增产物克隆、测序后获得河南长白猪IL-18基因成熟蛋白序列。利用基因重组技术将河南长白猪IL-18成熟蛋白编码区(500 bp)定向插入原核表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE-pIL-18,转化大肠杆菌M15,并用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。结果表明:经序列分析,河南长白猪IL-18基因全长为500 bp;SDS-PAGE分析可检测到分子质量约为45 ku的重组蛋白。 相似文献
6.
鸡白细胞介素-18基因的原核表达及多克隆抗血清的制备 总被引：9，自引：0，他引：9
将编码鸡白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体pPROEXTMHT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IPTG于37℃诱导培养。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在，目的蛋白表达量占菌体蛋白的30％。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-18融合蛋白相对分子质量约为23000。包涵体被6mol／L盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-18融合蛋白及其纯化产物经3次肌肉注射豚鼠，制备豚鼠抗鸡IL-18多克隆抗血清，并用琼脂扩散试验多克隆抗血清进行了证明。本试验成功的原核表达、纯化了鸡IL-18融合蛋白，并制备了抗鸡IL-18多克隆抗血清，为下一阶段关于鸡IL-18重组蛋白生物学特性及其应用的研究打下了坚实的基础。 相似文献
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鸡白细胞介素4基因的克隆及其原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
应用RT—PCR技术,从被诱导的鸡脾脏淋巴细胞中扩增鸡白细胞介素-4（ChIL-4）基因cDNA,经克隆筛选和测序后,构建出重组质粒pGEX-6P—ChIL-4和pET—ChIL-4,分别转化相应的受体菌,经IPTG诱导和SDS—PAGE分析,结果表明ChIL-4基因在上述载体中均获得表达,融合蛋白大小分别为38ku和18ku．Western blot结果也显示,在相对分子质量38ku和18ku位置有特异性条带。这为重组ChIL-4的规模化生产、疫苗佐剂的研制及其单克隆抗体的制备奠定了基础。 相似文献
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猪IL-6 cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达 总被引：2，自引：0，他引：2
运用RT—PCR方法,从经刀豆球蛋白A(ConA)诱导的猪外周血单核细胞(PMBcs)总RNA中扩增得到了猪IL-6(porcine IL-6,pIL-6)的cDNA,并将其克隆到pGEM—T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到的pIL-6cDNA与国外报道的完全一致,包括终止密码子在内其编码区的长度为639bp,编码212个氨基酸残基的蛋白质。将pIL-6成熟肽段编码区亚克隆至pET-28(a)中,构建成原核表达质粒pETPIL6。该质粒的BL21(DE3)LysS转化菌在IPTG的诱导下可高效表达plL-6,表达量占菌体总蛋白的30．60%-38．35％。 相似文献
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鸡白细胞介素15真核表达质粒构建及其体外表达 总被引：5，自引：0，他引：5
应用反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)技术AkConA刺激20 h的白菜航鸡脾脏T淋巴细胞中扩增出鸡白细胞介素15(ChIL-15)全基因片段.将其连接到克隆载体pMD18-T中得到重组克隆质粒pMD18-T-ChIL-15.阳性克隆质粒经鉴定正确后将ChIL-15亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,得到重组阳性表达质粒pcDNA3.1(+)-ChIL-15.阳性表达质粒经鉴定正确后应用磷酸钙法体外转柒293T细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了ChIL-15蛋白在293T细胞中的表达. 相似文献
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鸡白细胞介素18成熟蛋白全长基因的克隆与序列测定 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表的鸡白细胞介素 18(IL- 18)成熟蛋白的 c DNA序列 ,设计 1对特异性引物 ,应用 RT- PCR从脂多糖(L PS)刺激 10 h活化的 MDCC- MSB1细胞中克隆到编码鸡 IL - 18成熟活性蛋白的完整基因片段 ,其大小为 5 10 bp。经序列测定证实 ,所获得的 c DNA基因序列与文献报道的结果完全一致 ,从而为进一步研究鸡 IL- 18的基因表达、生物学活性以及应用奠定了基础。 相似文献
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根据基因库中鸡白细胞介素2基因序列设计一对特异性引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡的外周血淋巴细胞RNA中扩增,均得到大小为470 bp的特异性片断。将10个品种鸡的RT-PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上,得到重组质粒,经PCR和EcorⅠ、SalⅠ双酶切等方法鉴定后,测定鸡白细胞介素2基因序列。序列分析结果表明:广西10个地方优质品种鸡白细胞介素2基因都编码143个氨基酸的成熟蛋白,分子量约为16.3 ku,与哺乳动物和其他品种鸡核苷酸序列的同源性分别为24.8%-30.3%、98.8%-99.8%,氨基酸的同源性为14.6%-16.7%、96.5%-98.6%。 相似文献
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根据GenBank中所收录的鸡白细胞介素15(ChIL 15)的cDNA序列设计特异性引物,以经ConA刺激3 h的科宝鸡脾脏淋巴细胞的总RNA 为模板,用RT PCR 方法克隆获得了ChIL 15的cDNA。ChIL 15的cD NA全长655 bp,其中第84 位~644 位是该基因的阅读框(ORF),共编码187 个氨基酸。将所克隆的序列与已报道序列相比较,二者核苷酸的同源性为100%(655/655),所编码蛋白质的氨基酸序列同源性也为100%。 相似文献
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樱桃谷鸭白介素18基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
从鸡新城疫病毒刺激的鸭脾脏淋巴细胞培养液中提取基因组RNA，采用RT—PCR方法扩增鸭IL-18基因，插入pMD18-T载体，进行序列测定与分析。将成熟鸭IL-18基因亚克隆到表达载体PBCX中，并转化入大肠杆菌E．coliBL21进行表达。测序结果表明，该基因由603个核苷酸组成，包含一个完整阅读框，共编码201个氨基酸。表达载体经IPTG诱导表达出相对分子量约为59KD的融合蛋白。 相似文献
15.
Thomas JD Morris KR Godfrey DI Lowenthal JW Bean AG 《Veterinary immunology and immunopathology》2008,126(3-4):403-406
Zoonotic viruses, such as H5N1 Avian Influenza, pose major threats to both animals and humans, and with this in mind there is a need for the development of new anti-viral strategies. The cytokine interleukin-12 (IL-12) is known to play a pivotal regulatory role in the anti-viral response due to its role in the induction of the key anti-viral cytokine IFN-gamma. Therefore, strategies which provide a means for the production of therapeutic quantities of IL-12 may be of major benefit. Here we describe the development of biologically active Escherichia coli (E. coli) derived chicken IL-12 (ChIL-12). The single chain ChIL-12 gene was cloned into the pET32b expression vector, transformed into the BL-21 E. coli strain and expression induced with IPTG. Over expressed protein was solubilised with zwittergent detergent and isolated utilising Nickel ion affinity chromatography. Biological activity was determined as ChIL-12 stimulated proliferation of pre-treated T-cells in vitro. This study is the first example of a biologically active E. coli derived IL-12 from a non-mammalian vertebrate subsequently providing a means for testing the anti-viral therapeutic potential of ChIL-12 in an in vivo model. 相似文献
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为获得高活性的鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）VP2蛋白的重组蛋白,本试验对IBDV VP2蛋白基因与能进行自我组装的幽门螺杆菌（Hp）铁蛋白基因进行融合PCR扩增,获得其融合基因。根据成熟VP2蛋白基因cDNA序列和Hp铁蛋白基因的碱基序列,设计合成2对引物,应用融合PCR技术扩增获得融合基因片段VP2-Fe。将目的基因克隆至pMD18-T载体筛选阳性重组克隆质粒,然后将目的基因亚克隆至真核表达载体pPICZaC后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选获得阳性表达质粒。结果显示,通过两轮PCR扩增出长度为1 824 bp的融合基因VP2-Fe,亚克隆至pMD18-T载体,测序结果显示,融合基因无任何碱基的突变,筛选的阳性质粒命名为pMD-VP2-Fe。双酶切回收目的基因大小为1 824 bp,亚克隆至pPICZaC,PCR和双酶切鉴定出现预期大小的片段,将获得的阳性表达质粒命名为pPICZaC-VP2-Fe。本研究为后期利用真核表达载体获得其融合重组蛋白奠定基础。 相似文献
17.
从猪肌生成抑制素(MSTN)cDNA序列中设计引物。以pMD18-T-MSTN质粒为模板，PCR扩增猪MSTN成熟蛋白编码序列，该片段全长1095bp。将所得片段与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pMT—mpMSTN，将其转化到大肠杆菌DH5a中，成功地筛选到阳性克隆。双酶切重组质粒pMT—mpMSTN和真核表达载体pcDNA3．1，连接目的片段与载体pcDNA3．1，转化大肠杆菌DH5a，经酶切、PCR及测序分析，表明成功地构建了真核表达质粒pcDNA3．1-mpMSTN。 相似文献
18.
Wenyan Shi Qing Liu Jie Zhang Jingjing Sun Xiyue Jiang Jing Geng Fangkun Wang Yihong Xiao Hongmei Li Xiaomin Zhao 《Research in veterinary science》2014
In the present study, a naked EtMIC2 DNA vaccine, a ChIL-18 expression vector and a EtMIC2 and ChIL-18 co-expression DNA vaccine were constructed and their protective efficacies against homologous challenge were compared and evaluated by examining the body weight gain, oocyst shedding, cecal lesion, ACI as well as specific anti-EtMic2 antibody level, the proliferation ability and percentages of CD4+ and CD8+ of splenocytes. The results showed the naked EtMIC2 DNA vaccine could increase the weight gain and decrease the oocyst shedding, but could not alleviate the cecal lesion of immunized chickens compared to unimmunized chickens. Chickens immunized with the co-expression vector pVAX1-MIC2-IL-18 exhibited much improved immune protection against challenge compared to chickens immunized with naked EtMIC2 DNA vaccine, or with naked EtMIC2 DNA vaccine and ChIL-18 expression vector applied separately. These results suggest that the co-expression of ChIL-18 with EtMic2 together could significantly improve the immune protection of the EtMic2 protein. 相似文献
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Cloning and expression of goat interleukin-18 gene 总被引：3，自引：0，他引：3
Liu WQ Zhao HK Gao YD Zhong JF 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》2005,67(2):219-221
We isolated and sequenced a 480 bp cDNA encoding mature goat interleukin-18 (gIL-18) from alveolar macrophages and splenocytes activated with LPS by RT-PCR. The gIL-18 gene was cloned into pET32a (+) vectors and sequenced. Nucleotide sequence of gIL-18 shares high homology with cattle. Fusional expression with pET32a (+) of gIL-18 of about 38kD was obtained by SDS-PAGE analysis after induction by IPTG in the E. Coli BL21 expression system. The recombinant protein can induce IFN-gamma production in PBMC. The IL-18 mRNA was constitutively detected in goat alveolar macrophages with or without LPS, While, enhanced expression was detected in splenocytes and liver cells if treated by LPS, and can be weakly detected in Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) treated by activators. Significant deference of IL-18 mRNA level may reflect the capacity to produce mature IL-18 in such tissues. 相似文献