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1.
猪圆环病毒(PCV)能够引起多种综合征和疾病,给养猪业造成了较大的经济损失。PCV2毒株在2003年后以PCV2b取代PCV2a成为临床感染的猪群中最为流行的基因型。PCV基因组为单股负链环状DNA,其中ORF2编码病毒核衣壳蛋白Cap蛋白,Cap蛋白是主要的免疫原性蛋白。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2b的Cap蛋白基因克隆到杆状病毒载体中,通过制备杆粒、转染sf9细胞,获得表达PCV2b Cap蛋白的重组杆状病毒毒株,从IFA、SDS-PAGE及Western-blotting分析结果可以看出,该重组杆状病毒毒株成功表达了PCV2b Cap蛋白,为制备PCV2b Cap蛋白亚单位疫苗打下基础。 相似文献
2.
猪圆环病毒2型ORF2基因在Sf9细胞中表达及免疫原性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳(Cap)蛋白。将优化合成的PCV2 ORF2基因克隆到杆状病毒转移载体p Fast HTA中,并将鉴定正确的重组质粒p Fast HTA-Cap2转化至大肠杆菌感受态细胞,经蓝白斑筛选得到含有目的基因的重组杆状病毒质粒(r Bac-Cap2),转染至Sf9细胞,获得重组杆状病毒,对感染重组杆状病毒的细胞培养物进行重组蛋白的表达,进行SDS-PAGE和Western blot分析,并对表达的重组蛋白进行小鼠免疫试验及其病毒血清中和试验。SDS-PAGE分析表明,优化合成的PCV2 ORF2基因得到表达,蛋白分子质量大小为33 ku;Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清,表明重组蛋白具有反应原性;小鼠免疫试验结果显示,该蛋白能刺激机体产生特异性抗体,具有较好的免疫原性;病毒血清中和试验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1∶42。该蛋白在杆状病毒系统中的成功表达,为PCV2感染的诊断及亚单位疫苗的研制奠定基础。 相似文献
3.
猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达 总被引：3，自引：1，他引：3
猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础. 相似文献
4.
《中国动物传染病学报》2015,(4)
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)基因有两个主要的开放阅读框(open reading frame,ORF)。其中,ORF2编码病毒的主要结构蛋白核衣壳蛋白(Cap)。为了在昆虫细胞中表达Cap蛋白,本研究将重组穿梭质粒Bacmid-iel-ORF2经脂质体转染至昆虫细胞中,获得重组杆状病毒。经过噬斑克隆实验,获得稳定、高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,病毒滴度可达到1×109 pfu/m L。免疫印迹实验表明重组Cap蛋白可与PCV2阳性血清发生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应。本研究为提高PCV2灭活疫苗病毒滴度及免疫原性奠定了基础。 相似文献
5.
《浙江畜牧兽医》2017,(3)
试验通过PCR分别获得PCV2a和PCV2b的Cap基因,顺次克隆入pFast Bac-Dual载体质粒,获得携带2a和2b型Cap基因的重组质粒Cap-pFast Bac Dual,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒Cap-Bacmid,以脂质体法将重组杆粒转染Sf9细胞,获得表达Cap蛋白的重组杆状病毒。PCR能从重组杆状病毒中扩增出相应大小的Cap基因片段,蛋白电泳和ELISA法鉴定表明,Cap蛋白成功表达。采用重组杆状病毒肌内注射免疫小鼠(每只相当于8μg Cap蛋白),免疫后14 d血清中产生PCV2抗体,免疫后28 d用PCV2a和PCV2b强毒株攻击,荧光定量PCR法检测结果显示,免疫组小鼠脾脏中PCV2基因组拷贝数极显著低于未免疫对照组。结果表明,PCV2a和PCV2b双亚型重组Cap蛋白能开发成猪圆环病毒防控的新型疫苗。 相似文献
6.
本试验将猪圆环病毒2型(PCV2)去核定位区ORF2基因克隆到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC中,转化DH10Bac大肠杆菌感受态,经抗性及蓝白斑筛选得到含ORF2基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将此重组DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。对重组病毒进行Western-blot分析和免疫金电子显微镜检测。结果表明,PCV2 Cap蛋白在重组杆状病毒中获得表达;免疫金电子显微镜观察表明,重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上。本试验成功构建表面展示PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用重组杆状病毒作为亚单位疫苗奠定基础。 相似文献
7.
重组新城疫病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap)的重组新城疫病毒(NDV),本研究利用NDV LaSota弱毒疫苗株为活病毒载体,通过反向遗传操作系统构建出表达PCV2 Cap的重组病毒(rLa-PCV2/Cap),以及表达删除核定位信号(NLS)的Cap(Cap△41)的重组病毒(rLa-PCV2/Cap△41),并对外源蛋白的表达效果进行了检测.通过间接免疫荧光试验证明,两种重组病毒感染的BHK-21细胞中,PCV2 Cap蛋白以及删除NLS的Cap△41蛋白均获得正确表达;其中,完整的Cap蛋白定位于核内,而删除NLS的Cap△41蛋白则定位于胞浆中,本研究结果为研究新型PCV2疫苗奠定基础. 相似文献
8.
猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显著增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
9.
探索利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac expression system)分泌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PCV2 Cap基因克隆到已插入蜂毒信号肽(Melittin)的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒(pFastBAC-Cap)转化至DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含Cap基因的重组杆状病毒DNA(Bacmid-Cap),转染提取的Bacmid-Cap DNA转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBac-Cap),应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。重组蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)证明:在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示:重组蛋白可被猪PCV2的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/C小鼠试验结果显示:该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。该研究成功分泌表达了PCV2 Cap蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为PCV2亚单位疫苗的研制打下基础。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2019,(11)
试验旨在获得具有天然构象且反应原性良好的猪圆环病毒3型(porcine circoviurs 3,PCV3)Cap蛋白。以本实验室保存的PCV3 Cap基因为模板,设计不同引物扩增Cap基因,将其亚克隆至pEASY-Blunt载体上,验证正确后将目的基因分别克隆至杆状病毒表达载体pFastBac~(TM)上(含有双启动子),获得含有2个PCV3 Cap基因的重组质粒pFBD-P2C。将该重组质粒转化大肠杆菌DH10-Bac~(TM)感受态细胞当中,进行蓝白斑筛选,获得重组杆状质粒Bacmid P2C,利用脂质体转染至SF9细胞中进行病毒拯救,转染后72 h,收取上清病毒液,盲传3代,收取SF9细胞应用间接免疫荧光法(IFA)及Western blot检测目的蛋白是否表达。结果显示,重组质粒pFBD-P2C酶切验证正确,重组杆粒Bacmid P2C构建成功,杆状病毒中能够表达PCV3 Cap蛋白且能与His-tag抗体发生特异性反应,IFA鉴定出现特异性绿色荧光,表明成功表达了PCV3 Cap蛋白且具有反应原性,为深入开展PCV3抗体制备、新型疫苗研发奠定了基础。 相似文献