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杂合肽基因的合成及在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
将LfcinB15-Ma12杂合肽基因克隆到载体pET32a上,构建抗菌肽LfcinB15-Ma12杂合肽基因,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。根据已报道的抗菌肽LfcinB和Magainin基因的氨基酸序列,推导出其cDNA序列,将两者连接为杂合基因并克隆到载体pET32a上,IPTG诱导表达。构建了LfcinB15-Ma12杂合肽基因重组质粒,经PCR扩增和DNA测序分析,成功构建了LfcinB15-Ma12杂合肽基因重组质粒,经IPTG诱导,成功表达了杂合肽LfcinB15-Ma12。这为利用基因工程表达其他抗菌肽奠定了基础。 相似文献
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从人体肾脏组织中提取的总RNA中通过反转录PCR(RT-PCR)扩增得到了ELA2B基因,并将其克隆到pGEM-T easy载体中.然后用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ对重组质粒pGEM-T easy/ELA2B和大肠杆菌E.coli表达质粒pET30a进行双酶切,成功构建了原核表达载体pET30a/ELA2B.将重组质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21中,通过PCR和表型鉴定表明,ELA2B基因已经整合到大肠杆菌BL21染色体上.用IPTG对重组的大肠杆菌BL21进行诱导表达,得到的蛋白经SDS-PAGE分析结果表明:菌体中含有一明显特异性蛋白,大小为28 kD.经包涵体复性后在弹性蛋白酶活性检测平板上发现有代表弹性蛋白酶作用的透明圈产生,可初步证实表达产物具有生物活性. 相似文献
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克隆了堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)乳酸脱氢酶(LDH)基因(EaLDH),并在大肠杆菌中成功表达出重组蛋白.根据GenBank中收录的EaLDH核苷酸序列设计特异性引物,以其第一代裂殖体总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增获得EaLDH基因.将EaLDH基因片段与原核表达载体pET28a(+)连接,构建重组表达质粒pET28a(+)-LDH,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.结果表明,扩增出的EaLDH基因含993 bP的开放阅读框,与GenBank中收录的EaLDH基因序列相似性为98%.诱导后,重组蛋白能够在大肠杆菌中高效表达,融合蛋白相对分子质量约为4.1×104. 相似文献
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为获得具有抗原性的口蹄疫病毒(FMDV)3D蛋白N端T细胞表位的重组表达蛋白,根据FMDV3D蛋白前115位氨基酸序列,设计优化并人工合成相应的核酸序列,将其克隆至pET-28a中,构建原核表达质粒pET28a-115,并将重组质粒转化至BL21(DE3)细胞。经IPTG诱导后,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-bolt鉴定,结果显示,在16kD处有一条明显的蛋白表达条带。对表达产物进行可溶性分析,结果表达蛋白50%为可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后获得了较高浓度和纯度的目的蛋白。研究结果表明,含FMDV 3D蛋白前115位氨基酸的重组蛋白在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达,并具有较好的抗原活性,为开发口蹄疫诊断试剂和基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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【目的】克隆和表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)bioI基因并纯化表达产物。【方法】提取B.sub-tilis1A747基因组DNA,从中扩增bioI基因并将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)的表达载体pET-28a(+)上,构建bioI的表达载体pET28a-bioI。将重组质粒pET28a-bioI电转化到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,对表达产物BioI用Ni2+-NAT亲和层析树脂进行纯化,并对纯化蛋白进行波长扫描。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bioI,酶切鉴定结果正确并在大肠杆菌中表达成功,经IPTG诱导8 h后,重组蛋白BioI的表达量占总可溶性蛋白的20%;波长扫描发现,重组蛋白BioI在400 nm处有特征吸收峰。【结论】bioI基因克隆表达成功,其表达产物BioI具有P450蛋白的特征,为蛋白性质的进一步研究和抗体的制备奠定了基础。 相似文献
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根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M基因序列设计2对引物,通过PCR扩增得到了PRRSV M基因的全长片段和N-末端截短67个氨基酸序列的MNd67基因片段,分别将这些片段插入到表达质粒pET-28a(+)的多克隆位点上构建重组表达质粒,PCR、酶切及测序鉴定表明,成功构建了2种重组表达质粒(pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67)。重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)后利用α-乳糖诱导其表达,SDS-PAGE电泳分析表明,E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV MNd67成功表达分子质量为14ku的重组蛋白,而E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV M未见明显的表达蛋白。试验结果表明已成功表达截短的PRRSV M蛋白,可为PRRSV诊断抗原和疫苗研究奠定基础。 相似文献
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[目的]检测猪圆环病毒2型（PCV2）核衣壳蛋白（Cap）的表达,为进一步研制PCV2单克隆抗体检测抗原提供参考依据。[方法]根据已经发表的PCV2的衣壳蛋白基因（Cap）设计1对引物,利用PCR方法从已知PCV2病毒中扩增到1条DNA片段。将PCR产物按预定的阅读框架插入表达载体质粒pET28a（＋）中,获得重组质粒pCAP-PCV2,并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中。[结果]序列测定表明,所克隆的序列大小为579 bp,与DQ104422的Cap基因序列一致;通过对菌体裂解物的SDS-PAGE分析证明,携带重组质粒pET-PCV2-Cap的大肠杆菌可以表达可溶性的衣壳蛋白。[结论]PCV2衣壳蛋白能通过表达载体质粒pET28a（＋）进行可溶性表达。 相似文献
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【目的】鉴定谷氨酸棒状杆菌中ncgl 2588基因编码的苯酚羟化酶,并验证其在苯酚降解中的作用。【方法】构建谷氨酸棒状杆菌ncgl 2588基因缺失突变株,比较突变株和野生型菌株利用苯酚能力的差异;同时将ncgl 2588基因克隆到表达质粒pET28a中并转化入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导重组菌株原核表达,纯化并测定重组蛋白对苯酚的羟化作用。【结果】成功构建了谷氨酸棒状杆菌ncgl 2588基因缺失突变株,其在以苯酚为惟一碳源和能源的培养基中不能生长,而野生型谷氨酸棒状杆菌能正常生长;pET28a-ncgl 2588重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达分子质量为73ku的目的蛋白,此蛋白酶活为0.37mmol/(min·mg);在以苯酚为惟一碳源和能源培养谷氨酸棒状杆菌时,苯酚羟化酶得到最高表达,用其他芳香族化合物培养则苯酚羟化酶表达较少;进化树分析发现,谷氨酸棒状杆菌中的苯酚羟化酶与酵母Trichosporon cutaneum中的苯酚羟化酶序列同源性高达43%,远远高于与细菌中苯酚羟化酶的同源性。【结论】谷氨酸棒状杆菌中的ncgl 2588基因编码苯酚羟化酶,且该酶为可诱导酶,在苯酚降解中发挥着重要作用。 相似文献
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SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达 总被引：1，自引：1，他引：0
对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对SARS病毒N蛋白基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-N,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp,编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100%。将pGEM-N双酶切,回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-N;将其转化表达菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明:重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Western-blotting证实,重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43%。 相似文献
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研究了家蝇幼虫抗菌肽MDL-2对细菌细胞壁的溶解作用、细胞膜渗透性和代谢的影响.抗菌肽MDL-2在抗菌过程中首先与细菌的细胞壁相互作用,使其破裂.菌肽对革兰氏阴性细菌大肠杆菌的细胞壁的作用有浓度依赖性,而对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌,MDL-2在较低的浓度时即具有破坏细胞壁的作用;抗菌肽MDL-2与金黄色葡萄球菌的细胞膜作用曲线呈现典型的S型,有较强的协同效应,并随着作用时间的延长细胞的渗透性增强;抗菌肽对细菌的代谢功能有较强的干扰作用,阻碍菌体的生命活动,加速菌体死亡. 相似文献
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牛乳铁蛋白活性多肽(Lactoferricin B,LfcinB)是一种阳离子型抗菌肽,因其具有多种生物学功能,现已被认为具有能够替代传统抗生素的发展前景。然而,由于传统的分离制备方法存在诸多弊端,所以基于基因工程的原核表达技术在制备高纯度和高效表达的该蛋白方面具有极其深远的意义。研究旨在摸索出一套完整的利用原核表达技术制备LfcinB的分子生物学方法。依据大肠杆菌密码子偏爱性的原则,设计了LfcinB的基因序列,通过人工合成的方法获得该基因的优化序列,借助Bam HI和Sal I双酶切、连接等手段将其构建到原核表达载体pGEX-4T-2上,获得重组表达载体pGEX-4T-2-LCB,将该载体转化E.coli Rosetta(DE3)。使用IPTG诱导,结果发现LfcinB在大肠杆菌中表达量超过20%。通过一系列蛋白纯化技术分离得到纯度达到95%以上的LfcinB融合蛋白。抑菌试验结果表明,重组抗菌肽LfcinB融合蛋白具有很好的抑菌活性。研究结果为人们使用基因工程技术制备抗菌肽LfcinB提供了具有重要参考价值的技术路线和理论依据。 相似文献
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牛乳铁蛋白素-马盖宁杂合抗菌肽的设计、合成及抑菌活性 总被引：1，自引：0，他引：1
根据抗菌肽牛乳铁蛋白素(Lfcin B)与马盖宁(Magainin)的核心功能序列,将Lfcin B(1-15)和Magainin(1-12)二者连接起来,设计一种新型杂合抗菌肽LFB15-MA12,采用固相化学合成法合成获得纯度大于95%的LFB15-MA12.微量肉汤稀释法测得LFB15-MA12对金黄色葡萄球菌A... 相似文献
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根据MagaininⅡ氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱密码子,化学合成了2个DNA片段,利用重叠区互补PCR法得到MagaininⅡ的基因序列.构建了融合表达载体pET21 b-MagaininⅡ,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,在5.1 kD处可见目的蛋白条带,... 相似文献
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为了解抗菌肽泰立停与抗生素联合的抑菌作用,本研究通过倍比稀释法和纸片法测试了泰立停和抗生素在单用和联用时对大肠杆菌和沙门菌的抑菌活性。结果表明,通过倍比稀释法和纸片法,泰立停和抗生素(安普霉素、恩诺沙星和多西环素)在单用时对大肠杆菌和沙门菌均有不同程度的抑菌活性,在联合使用时,倍比稀释法观察到泰立停与恩诺沙星的联合可以提高对大肠杆菌CVCC1568的抑菌活性；纸片法观察到仅泰立停与多西环素在8/2的比例进行联合时对大肠杆菌AE1具有联合抑菌作用,同时观察到泰立停与抗生素联合时,抑菌效果与抗生素单用的效果相当。说明抗菌肽泰立停与某种抗生素的联合可针对某种菌的某些菌株有很好的抑菌活性,同时可以降低抗生素的使用剂量。这将减少抗生素在临床中的应用,进而可避免或减少耐药菌的形成,从而维护人与动物的健康,保护生态环境。 相似文献
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草鱼肠道抗菌肽对细菌形态结构的影响及理化性质研究 总被引：2，自引：0，他引：2
通过扫描电子显微镜观察草鱼肠道抗菌肽处理后的大肠杆菌、金色葡萄球菌、嗜水气单胞菌的形态结构的变化.结果显示,经过抗菌肽处理后的细菌形态发生变化,菌体严重变形,表面变得粗糙,出现皱褶,胞膜破裂.对草鱼肠道抗菌肽的理化性质的研究结果显示,草鱼肠道抗菌肽具有很好的热稳定性,耐胰蛋白酶特性. 相似文献
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大菱鲆hepcidin抗菌肽基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过同源克隆结合RACE的方法从大菱鲆(Scophthal mus maximus)肝脏中克隆了大菱鲆hepcidin抗菌肽基因全长cDNA(GenBank accession number AY994074)。大菱鲆hepcidin基因cDNA全长778bp,包含有1个273bp的开放阅读框,编码1个长90氨基酸的前体肽。将大菱鲆hepcidin抗菌肽基因的成熟肽序列重组至原核表达载体pGEX-4T-1中,用IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示在29ku处有特异性蛋白条带出现,表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白约占总蛋白的26%。Western-blotting分析发现表达的融合蛋白可以特异性地与GST抗体相识别。这些结果表明大菱鲆hepcidin抗菌肽基因成功实现了原核表达。 相似文献
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尼罗罗非鱼Hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌活性 总被引：2，自引：1，他引：1
Hepcidin是一类分子量较小、富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,TH1-5则是从莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)中分离到的3种hepcidin cDNA序列中的1种;虽然化学合成的TH1-5的成熟肽显示了对若干细菌的抑菌活性,但通过重组DNA表达的此肽是否也具生物学活性则是未知的。本文参考莫桑比克罗非鱼hepcidin TH1-5的核苷酸序列,以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的肝脏为基因克隆的材料,对其类似于hepcidin TH1-5的成熟肽(mTH)进行了重组DNA表达。在构建的重组表达质粒"pET-32a-mTH"中,mTH基因与携带有6×His-tag标签和肠激酶识别位点的trxA基因融合,25℃下,经1mmol/L IPTG诱导培养8h后,在E.coli BL21(DE3)中成功表达了"trxA-mTH"融合蛋白。经固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化后的融合蛋白并不显示抑菌活性,但经肠激酶消化处理后,释放出的重组mTH显示了对革兰氏阳性的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌以及革兰氏阴性的大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌活性。 相似文献
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鸭抗菌肽Cathelicidin分子[Cath(1-20)]富含疏水性氨基酸及正电荷,通过人工方法设计合成Cath(1-20)的截短肽衍生物,筛选新型安全Cath(1-20)衍生肽,探讨其作用机制。结果表明,与母肽Cath(1-20)相似,三种衍生肽Cath(5-20)、Cath(4-20)、Cath(3-20)均具有明显广谱抑菌活性,MIC值在1~8μmol·L~(-1)范围内,但仅Cath(5-20)溶血及细胞毒性明显降低,治疗指数达19.5,显著高于Cath(1-20)、Cath(4-20)及Cath(3-20)。Cath(1-20)及其衍生肽可破坏E.coli UB1005的内膜完整性,产生去极化作用,并存在时间和剂量依赖效应;透射电镜结果显示Cath(1-20)及Cath(5-20)可破坏细菌细胞膜。研究证实氨基端的色氨酸对鸭抗菌肽Cath(1-20)溶血及细胞毒性起关键作用,其作用靶点主要为细菌细胞膜。 相似文献
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[目的]确定大肠杆菌菌液刺激蝇蛆产生浓度高、活性强的抗菌肽时间和蝇蛆饲喂家禽的安全性。[方法]采用不同浓度的大肠杆菌菌液分别与麸皮混合饲喂蝇蛆,于10、24、48 h分别收集存活蝇蛆并对其粗提取抗菌肽,通过考马斯亮蓝法和抑菌试验分别测定各试验组抗菌肽粗提液的浓度和抑菌力,同时用CFU计数法测定细菌培养的家蝇幼虫的细菌含量以确定其作为绿色抗生素的安全性。[结果]浓度为3.0×107cfu/ml的大肠杆菌作用24 h的蝇蛆组产生的抗菌肽浓度最高、活性最强,且蝇蛆体内细菌含量为1.6×105cfu/g,低于国家规定的饲料细菌标准含量最低值(2×106cfu/g)。[结论]为进一步利用动物死尸、畜禽粪便生物转化蝇蛆产生大量安全、浓度高且活性强的蝇蛆抗菌肽作为绿色抗生素运用于禽类养殖业奠定了基础。 相似文献