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1.
为建立一种快速的兔病毒性出血症病毒抗体检测方法,参照已发表的RHDV基因序列,采用RT-PCR扩增了长约510 bp的VP60基因片段,连接PGEX-4T-1表达载体后获得了以包涵体形式表达的重组VP60蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测兔病毒性出血症病毒抗体的VP60-ELISA诊断方法。该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为RHDV的快速诊断、免疫兔群抗体监测和实验兔等级检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。 相似文献
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为建立一种快速的兔病毒性出血症病毒抗体检测方法,本研究以原核表达的重组VP60蛋白作为诊断抗原,建立了检测兔病毒性出血症病毒抗体的VP60-ELISA诊断方法。该方法检测3种常见兔病(兔轮状病毒、仙台病毒和魏氏梭菌)的阳性血清均为阴性;检测灵敏度为1:12800;批内、批间重复性试验的变异系数分别小于4.9%和6.9%。本研究建立的RHDV VP60-ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为RHDV的抗体检测及流行病学调查等快速诊断提供了一种技术手段。 相似文献
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为获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原,本研究对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了原核表达与初步应用。参照ZB株分离病毒VP60基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增长876bp的VP60基因片段。将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中,经鉴定正确后,重组质粒转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,重组蛋白纯化后,Western blot检测表明具有良好的抗原性与特异性,以该蛋白作为诊断抗原,初步建立了检测兔瘟病毒抗体的间接ELISA诊断方法。本研究为RHDV分子流行病学调查提供了参考,为VP60蛋白结构与功能研究、RHDV抗体检测试剂盒及新型疫苗的研制奠定基础。 相似文献
4.
兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果 总被引：2，自引：1，他引：1
用RT—PCR方法扩增兔出血症病毒（RHDV）衣壳蛋白VP60基因,通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bacmid—VP60,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV—Bac—VP60,经RT—PCR、IFA、SDS-PAGE、Western blotting、HA和HI鉴定,结果显示重组VP60蛋白在Sf9昆虫细胞中得到表达。在不加任何佐剂的情况下,用表达的蛋白免疫3月龄非RHD免疫兔,结果显示,免疫后21天,兔体内可产生抗RHDV抗体,抗体血凝抑制效价为2^6～2^7,该抗体可以抵抗血凝效价为2^10致死剂量RHDV强毒的攻击,本研究为兔病毒性出血症基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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为建立兔出血症病毒(RHDV)的血清学检测方法,本实验通过生物信息学分析,将RHDV衣壳蛋白VP60的3个区域VP60-1(aa2-aa208)、VP60-2(aa174-aa425)和VP60-3(aa342-aa579)分别进行原核表达,获得了大小为42 ku、47.5 ku和45.6 ku的重组蛋白。经ELISA和western blot试验分析显示3种重组蛋白均能够被RHDV阳性血清识别,但VP60-1较VP60-2和VP60-3具有更好的反应原性,因此以表达的重组蛋白VP60-1作为包被抗原建立了RHDV间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,对不同免疫期兔血清的检测结果与HI呈显著相关性。对临床样品的检测结果表明该ELISA方法比HI试验更敏感。本研究以VP60-1为包被抗原建立的ELISA方法可以用于RHDV疫苗的免疫评估。 相似文献
6.
TaqMan MGB探针实时检测兔病毒性出血症病毒 总被引：3，自引：0，他引：3
应用荧光定量PCR技术,根据兔病毒性出血症病毒的保守基因VP60设计了1对引物和1段Taqman MGB探针,建立了用于检测兔病毒性出血症病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。试验中能够检出的RHDV VP60基因质粒拷贝数达103数量级,能够检测到RHDV病毒核酸最低量可以达到5 pg,未检出其他病原的RNA。试验结果表明,建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量RT-PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的兔病毒性出血症病毒,适合于兔各脏器及肌肉组织中兔病毒性出血症病毒的快速诊断和检测。 相似文献
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兔出血症病毒胶体金免疫层析试纸条诊断方法的建立及初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为了建立一种快速、简便的兔出血症病毒(RHDV)的检测方法,用胶体金标记纯化的RHDV多克隆抗体,以杆状病毒表达系统表达的重组RHDV VP60蛋白为免疫原制备RHDV的单克隆抗体(McAh,简称单抗)A3C,将RHDV McAb和羊抗兔IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,经条件优化研制成RHDV免疫胶体金试纸条.该试纸条可以检出红细胞凝集试验(HA)效价为1:10的RHDV悬液,即HA检测为阴性的样品,该试纸条检测为阳性,其敏感性高于HA;特异性试验结果显示,该试纸条不与家兔其他常见病菌发生交叉反应.应用该试纸条对127份疑似兔出血症家兔肝脏样品进行初步检测,同时用HA做平行试验,阳性符合率为100％.因此,该试纸条是一种快速、灵敏、特异的兔出血症病毒检测方法,为兔出血症的现场诊断提供了有效的方法,显示出很好的临床应用前景. 相似文献
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为分析兔出血症病毒地方分离株的变异情况,并获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原,对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了克隆、序列分析与原核表达.ZB株分离病毒与GenBank中的6株RHDV VP60基因的核苷酸序列同源性在92.5％～97.9％之间,参照ZB株分离病毒VP60基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增了876 bp的VP60基因片段.将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中,经鉴定正确后,重组质粒转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,重组蛋白纯化后,Western blot检测表明具有良好的抗原性与特异性. 相似文献
9.
为建立一种检测兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）抗体的间接ELISA方法,首先扩增了VP60的优势抗原区A（31～250 aa）和B（470～579 aa）两个片段,然后应用融合PCR方法将A、B片段连接起来,克隆至pET-30a（＋）,转染BL21感受态细胞,进行原核表达。用Western blot方法对表达产物（AB）的免疫原性进行鉴定,再以纯化的AB为诊断抗原,通过对抗原-抗体反应条件的多重优化,建立检测RHDV抗体的间接ELISA方法。试验结果表明,本研究成功表达了RHDV VP60的优势抗原区（AB）,重组蛋白的分子量约为36 kDa,该蛋白能与RHDV抗体发生特异性反应。以纯化的AB为包被抗原,成功建立了检测RHDV抗体的间接ELISA方法。经过对部分田间样品的检测和应用,证明该方法具有特异性强、重复性好、敏感性高等优点。本研究为将来开展RHDV的流行病学调查和疫苗研究等提供了良好的技术手段。 相似文献
10.
试验旨在分离兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝（HA）和血凝抑制（HI）检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD50测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人"O"型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV （AV33）抗血清抑制,该毒株的LD50为10-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740 bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株（RHDVa）,与RHDV1和RHDV2 VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%~97.6%和81.1%~81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%~98.3%和87.4%~87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta （DE3）中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74 ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。 相似文献
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建立一种检测兔病毒性出血症病毒(RHDV)抗体的间接ELISA方法。对RHDV陕西分离株VP60基因进行原核表达,Western blot分析表达产物的免疫反应性;以纯化的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对反应条件进行优化。结果表明,VP60蛋白在大肠杆菌中成功表达,产物约为42.34 ku的融合蛋白,具有良好的反应原性;优化的ELISA最佳工作条件为:重组抗原包被浓度2.9μg/mL,37℃2 h后4℃过夜,1%BSA 37℃封闭2 h,待检血清37℃孵育1 h,酶标抗体1∶10 000稀释,37℃作用1 h,37℃显色5 min,临界值为0.340;建立的ELISA方法特异性强、重复性好、敏感性高;临床检测180份样品,与血凝抑制试验的符合率为74.1%,与商品化试剂盒检测结果符合率为94.8%。该方法可用于临床样品的大批量检测。 相似文献
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Fernández E Toledo JR Chiong M Parra F Rodríguez E Montero C Méndez L Capucci L Farnós O 《Veterinary immunology and immunopathology》2011,142(3-4):179-188
Rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) is the etiological agent of a lethal and contagious disease of rabbits that remains as a serious problem worldwide. As this virus does not replicate in cell culture systems, the capsid protein gene has been expressed in heterologous hosts or inserted in replication-competent viruses in order to obtain non-conventional RHDV vaccines. However, due to technological or safety issues, current RHDV vaccines are still prepared from organs of infected rabbits. In this work, two human type 5 derived replication-defective adenoviruses encoding the rabbit hemorrhagic disease virus VP60 capsid protein were constructed. The recombinant protein was expressed as a multimer in mouse and rabbit cell lines at levels that ranged from approximately 120 to 160 mg/L of culture. Mice intravenously or subcutaneously inoculated with a single 10(8) gene transfer units (GTU) dose of the AdVP60 vector (designed for VP60 intracellular expression) seroconverted at days 7 and 14 post-immunization, respectively. This vector generated a stronger response than that obtained with a second vector (AdVP60sec) designed for VP60 secretion. Rabbits were then immunized by parenteral or mucosal routes with a single 10(9)GTU dose of the AdVP60 and the antibody response was evaluated using a competition ELISA specific for RHDV or RHDVa. Protective hemagglutination inhibition (HI) titers were also promptly detected and IgG antibodies corresponding with inhibition percentages over 85% persisted up to one year in all rabbits, independently of the immunization route employed. These levels were similar to those elicited with inactivated RHDV or with VP60 obtained from yeast or insect cells. IgA specific antibodies were only found in saliva of rabbits immunized by intranasal instillation. The feasibility of VP60 production and vaccination of rabbits with replication-defective adenoviral vectors was demonstrated. 相似文献
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Zai Xin Li Wei Dong Hu Bing Chao Li Tian You Li Xiao Yang Zhou Zhi Zhang 《Veterinary immunology and immunopathology》2014,157(1-2):97-104
VP60 capsid protein is the major structural and immunogenicity protein of RHDV (Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV), and has been implicated as a main protein antigen in RHDV diagnosis and vaccine design. In this report, egg yolk antibody (IgY) against N-terminal of VP60 was evaluated and developed as a new strategy for RHDV therapy. Briefly, N-terminal of VP60 (～250aa) fragment was cloned and inserted into pET28a expression vector, and then the resultant plasmid, pET28a/VP60-N, was transformed into E. coli BL21(DE3) for recombinant VP60-N protein (rVP60-N) expression. Next, the rVP60-N was purified by Ni+-affinity purification chromatography and identified by Western blotting with RHDV antiserum. After immunizing the chickens with rVP60-N, the anti-rVP60-N IgY was isolated, and the activity and specificity of the IgY antibody were analyzed by ELISA and Western blotting. In our results, the rVP60-N could be expressed in E. coli as soluble fraction, and the isolated anti-rVP60-N IgY demonstrated a high specificity and titer (1:22,000) against rVP60-N antigen. For further evaluation of the IgY efficacy in vivo, rabbits were grouped randomly and challenged with RHDV, and the results showed that anti-rVP60-N IgY could significantly protect rabbits from virus infection and promote the host survival after a sustained treatment with anti-rVP60-N IgY for 5 days. Taken together, our study demonstrates evidence that production of IgY against VP60 could be as a novel strategy for the RHDV therapy. 相似文献
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为评价兔出血症病毒(RHDV)VP60基因在小鼠体内诱导产生体液免疫和细胞免疫情况,本研究构建了RHDV VP60基因的真核表达质粒pcDNA-VP60,并将其免疫小鼠。利用ELISA方法检测特异性抗体和小鼠外周血细胞因子水平,MTT法和流式细胞术(FACS)检测小鼠外周血T淋巴细胞增殖情况和T淋巴细胞亚群的动态变化。抗体检测结果显示,重组质粒免疫组抗体水平在免疫后5周～6周达到峰值,而且与对照组比较差异显著(p<0.05);细胞因子检测结果显示,重组质粒免疫组血清中IFN-γ、IL-2、IL-4因子水平随免疫时间延长而升高,并且能够维持较高水平,与对照组比较差异显著(p<0.05);T淋巴细胞检测结果显示,重组质粒免疫组T淋巴细胞明显增殖,CD4+T淋巴细胞数量免疫后明显增高,与对照组比较差异显著(p<0.05);所有检测指标显示重组质粒免疫组和灭活苗免疫组比较均无显著差异(p>0.05)。以上结果表明pcDNA-VP60重组质粒可以诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫,为研制预防兔病毒性出血症的候选DNA疫苗提供了实验依据。 相似文献
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基因重组抗原酶联免疫法检测兔出血症病毒抗体及其标准化 总被引：2，自引：0，他引：2
以重组兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白为抗原，建立了RHDV抗体间接ELISA检测方法。优化的试验反应务件为：重组VP60的包被质量浓度为1．0mg／L，用10％牛血清封闭，以大肠杆菌提取物稀释被检血清以消除非特异性反应。将所建立的ELISA与现行血凝抑制(HI)试验比较发现，不同免疫状态的兔血清的RHDV ELISA抗体与HI抗体均呈正相关。对11个RHD免疫兔场1130份血清样品的抗体检测表明，各免疫兔群血清RHDV抗体水平不完全一致，D值在1．09～1．76之间，显著高于非免疫兔(0．05)及SPF兔(0．02)，低于高免兔(2．34)。在此基础上，研制了RHDV抗体酶联免疫检测试剂盒，测定了其主要指标，制定了各成分的质量控制标准，为兔群进行免疫学监测及评价疫苗的免疫效果提供了便利。 相似文献
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中国株兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性鉴定 总被引：11，自引：0，他引：11
应用RT—PCR技术扩增编码兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)WX84株衣壳蛋白VP60基因，将PCR产物按相应的阅读框架克隆到表达性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21株，在1．0mmol／L 1PTG和37C的条件下诱导，VP60—GST基因融合蛋白获了高效表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和western-blotting试验证实所表达的融合蛋白产物相对分子质量与预期的87000相符。将表达产物经电泳切胶回收目的条带后免疫小鼠，所得抗血清应用间接ELISA检测，与RHDV病毒粒子呈阳性反应。试验结果表明，大肠杆菌中表达的RHDVVP60融合蛋白在抗原性上与天然衣壳蛋白具有一定的相似性。 相似文献