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1.
《中国预防兽医学报》2015,(2)
为研究和比较牛病毒性腹泻病毒(BVDV)囊膜蛋白E0和E2基因作为核酸疫苗候选基因的免疫效果,本实验构建了真核重组表达质粒p VAX1-E0和p VAX1-E2,并转染至293T细胞中,通过RT-PCR和western blot方法检测目的基因在293T细胞中的转录和表达情况。同时将重组质粒联合基因佐剂p VAX1-IL-2免疫小鼠,ELISA检测其中和抗体,结果表明,p VAX1-E0免疫组能够有效的诱导特异性血清抗体的产生,而p VAX1-E2免疫组效果不明显。MTT检测显示两组均显著促进了特异性淋巴细胞的增殖,并且p VAX1-E2组效果优于p VAX1-E0组。由此表明,p VAX1-E0可以诱导较好的体液免疫,而p VAX1-E2在细胞免疫方面效果较好。 相似文献
2.
为构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白P27慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞LMH中的表达,试验以实验室前期构建的pcDNA3.1-p27为模板,扩增p27基因,克隆入pLVX-IRES-ZsGreen1载体,构建的重组质粒命名为pLVX-p27,与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染至HEK293T细胞,包装获得表达p27基因的重组慢病毒。将慢病毒上清感染293T和LMH细胞,检测细胞中p27基因的转录水平和蛋白表达水平。结果显示:重组质粒pLVX-p27构建正确,收集的慢病毒上清滴度为9×104TU/mL;实时荧光定量PCR、Western blot和共聚焦荧光试验结果显示P27蛋白主要定位于胞浆,p27基因的RNA和蛋白表达量在感染后96 h内随着感染时间延长逐渐升高。研究表明:表达p27基因的慢病毒包装成功,并且能感染293T及禽源LMH细胞,为进一步研究P27的生物学功能提供了工具。 相似文献
3.
为提高牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD/MD)核酸疫苗的免疫效力,本实验应用PCR方法扩增BVD病毒(BVDV) E0基因,构建真核表达质粒pVAX1-E0,转染293T细胞,经RT-PCR和western blot分析显示,转染细胞能够瞬时表达E0蛋白.并分别将pVAX1、pVAX1-E0或将pVAX1-E0分别与一种表达细胞因子基因的重组质粒作为佐剂(pVAX1-IL-2、pVAX1-IL-4及pVAX1-IFN-γ)免疫小鼠,采用间接ELISA法检测免疫小鼠BVDV抗体效价,以MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖活性.实验结果表明,与pVAX1-E0相比,接种pVAX1-E0/pVAX1-IL-2小鼠血清E0抗体水平及淋巴细胞增殖水平显著提高(p＜0.01),表明细胞因子基因佐剂IL-2能够有效提高BVDV E0核酸疫苗免疫效果,可以刺激小鼠产生良好的免疫应答. 相似文献
4.
表达猪瘟病毒石门株E0抗原的重组腺病毒构建及免疫性的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
应用PCR从pMD18-T-E0质粒中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带CSFV E0基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E0,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒pAd-E0,PCR证实E0基因已整合至腺病毒基因组中,用Western blot检测到重组病毒感染293细胞中E0蛋白的表达。重组病毒免疫小鼠和猪,结果2次免疫后产生明显的免疫应答,ELISA检测小鼠血清抗体滴度分别为1∶512和1∶10240;猪血清抗体滴度分别为1∶16和1∶64。本研究成功构建了表达猪瘟病毒E0基因的非复制型重组腺病毒,该重组病毒免疫小鼠可产生较高的抗体滴度,免疫猪后能提供一定的保护效果。 相似文献
5.
Viperin是一种细胞内抗病毒蛋白,可以被I型干扰素、多聚I:C、脂多糖及多种病毒诱导表达,在细胞内主要定位在内质网和脂滴,具有广谱的抗病毒功能。为研究马Viperin(eViperin)在抗病毒感染中的作用,本研究应用RT-PCR从马巨噬细胞中扩增eViperin基因,并将其克隆于真核表达载体pDC315中构建重组质粒pDC-eViperin-Flag,将重组质粒转染293T细胞,western blot检测结果表明eViperin在293T细胞中正确表达。将该重组表达质粒与表达马传染性贫血病毒(EIAV)Gag前体蛋白(Gag precursor,Pr55gag)的表达质粒共转染293T细胞,转染48 h后western blot检测,结果显示实验组细胞培养上清中的Pr55gag含量显著低于空白对照组,表明eViperin具有抑制EIAV释放的作用。此外,将该重组表达质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1,E3Cre共转染HEK293细胞,进一步构建拯救出表达eViperin的重组腺病毒,为研究eViperin的抗病毒功能研究奠定了基础。 相似文献
6.
表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
7.
《畜牧兽医学报》2021,(1)
本研究计划构建能同时表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)优势抗原基因的重组质粒并研究其免疫效果,旨在为BVD-IBR二联核酸疫苗的研制提供参考。采用PCR扩增目的基因E0及gD并将其依次连接至真核表达载体pVAX1-IRES中,构建pVAX1-E0-IRES-gD重组真核表达载体;将pVAX1-E0-IRES-gD转染至293T细胞中,间接免疫荧光法检测目的基因在细胞中的表达情况;将pVAX1-E0-IRES-gD以不同剂量采用肌内注射的方式接种小鼠,通过抗体水平和细胞因子检测以及脾淋巴细胞增殖试验对该重组质粒的免疫效果进行评价。结果表明,成功构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒,目的基因在293T细胞内成功表达。在抗体和细胞因子水平以及脾淋巴细胞增殖能力这3个指标,重组质粒组均极显著高于空载体和阴性对照组,高剂量免疫组优于中、低剂量组;另外,高剂量重组质粒免疫组与二联灭活疫苗组相比无显著性差异。结果显示,成功构建了共表达BVDV E0和IBRV gD基因的重组质粒,体外表达检测证明目的蛋白具有良好的反应原性,动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答。 相似文献
8.
猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。 相似文献
9.
构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞系(LMH)中的表达情况,以探讨p15基因对病毒复制、免疫信号通路的影响。以真核表达质粒pCAGGS-p15为模板扩增p15全长基因,经双酶切后克隆到慢病毒载体plvx-IRES-ZsGreen1上,构建成plvx-p15-Flag慢病毒表达质粒,将该质粒与辅助质粒共转染293T细胞产生慢病毒,将细胞上清中的病毒感染LMH细胞,检测p15蛋白表达情况。慢病毒载体在293T细胞上包装完成后,病毒滴度为2.25×105 TU/mL。慢病毒感染LMH细胞,基因和蛋白水平检测结果表明,p15蛋白表达良好。表达ALV p15基因的慢病毒包装成功,并且能够感染鸡源LMH细胞。该载体的构建为进一步研究p15蛋白的生物学功能提供工具。 相似文献
10.
《中国畜牧杂志》2015,(3)
构建冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究CIRP功能提供基础工具。本研究从4℃冷处理8 h的SD大鼠睾丸组织中获得CIRP的cDNA序列测序后,将其克隆入LV5质粒中,经双酶切及测序鉴定;利用脂质体将鉴定的阳性重组LV5-cirp表达载体与pGag/Pol、pRev、pVSV-G 3个质粒共转染到HEK-293T细胞,72 h收获上清,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染293T细胞,检测病毒滴度,以及采用Western blot方法验证基因表达情况。结果表明:经琼脂糖凝胶电泳鉴定、PCR鉴定、酶切及测序结果证明成功构建了LV5-cirp重组质粒,序列比对与设计序列符合率100%,并成功包装成慢病毒,病毒滴度为6.30×108TU/m L;将制备成功的CIRP慢病毒过表达载体感染293T细胞后,Western blot检测结果显示细胞中CIRP蛋白表达水平显著高于正常细胞以及慢病毒阴性对照组(P0.01)。本实验成功构建CIRP慢病毒过表达载体并完成了慢病毒包装及滴度的测定,为今后的研究提供了基础工具。 相似文献
11.
Tetherin是新发现的具有限制多种病毒从细胞膜释放功能的细胞蛋白。本研究采用RT-PCR技术从恒河猴巨噬细胞中扩增Tetherin基因,将其插入真核表达载体pEF4/myc-His B中构建重组质粒pHF-Tetherin。并将其转染293T细胞,通过western blot和激光共聚焦分析Tetherin在293T细胞中的表达及亚细胞定位。将pHF-Tetherin分别与马传染性贫血病毒(EIAV)或猴免疫缺陷病毒(SIV)假病毒粒子感染性质粒共转染293T细胞,分析Tetherin对EIAV及SIV出芽的限制作用。研究结果表明,pHF-Tetherin转染293T细胞48 h后可以检测到Tetherin的表达并定位于细胞膜,而且该蛋白具有抑制EIAV及SIV从转染细胞中出芽的生物学功能。 相似文献
12.
《中国预防兽医学报》2015,(6)
为建立稳定表达施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳(N)蛋白的BHK-21细胞系,本研究在SBV-N蛋白编码基因的C端加入6个组氨酸(6×His)标签,将其克隆至慢病毒载体p LV-EGFP-C中构建重组慢病毒质粒p LV-EGFP-SBV-N,将其与慢病毒包装质粒p Helper1.0和p Helper2.0共转染HEK-293T细胞,包装表达SBV-N蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染BHK-21细胞,采用嘌呤霉素(Puromycin)法和细胞有限稀释法筛选出一株稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系,命名为BHK-21-EGFP-SBV-N。间接免疫荧光试验进一步表明,该细胞系能够被SBV抗体阳性动物血清和特异性单克隆抗体2C8识别。稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系的建立,为SBV血清学检测方法的建立提供材料。 相似文献
13.
本研究计划构建能同时表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）优势抗原基因的重组质粒并研究其免疫效果,旨在为BVD-IBR二联核酸疫苗的研制提供参考。采用PCR扩增目的基因E0及gD并将其依次连接至真核表达载体pVAX1-IRES中,构建pVAX1-E0-IRES-gD重组真核表达载体;将pVAX1-E0-IRES-gD转染至293T细胞中,间接免疫荧光法检测目的基因在细胞中的表达情况;将pVAX1-E0-IRES-gD以不同剂量采用肌内注射的方式接种小鼠,通过抗体水平和细胞因子检测以及脾淋巴细胞增殖试验对该重组质粒的免疫效果进行评价。结果表明,成功构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒,目的基因在293T细胞内成功表达。在抗体和细胞因子水平以及脾淋巴细胞增殖能力这3个指标,重组质粒组均极显著高于空载体和阴性对照组,高剂量免疫组优于中、低剂量组;另外,高剂量重组质粒免疫组与二联灭活疫苗组相比无显著性差异。结果显示,成功构建了共表达BVDV E0和IBRV gD基因的重组质粒,体外表达检测证明目的蛋白具有良好的反应原性,动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答。 相似文献
14.
《中国预防兽医学报》2016,(11)
为真核表达梅花鹿干扰素β1(IFN-β1)并检测其抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)活性,本研究以梅花鹿肝脏基因组为模板,通过PCR扩增出IFN-β1的编码区序列,克隆于真核表达载体pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAX1-IFNβ1,并转染MDBK细胞进行表达。结果显示,将pVAX1-IFNβ1转染MDBK细胞后经western blot和间接免疫荧光法检测和鉴定证实,转染的重组质粒能够在MDBK细胞中正确表达目的蛋白,表达的重组蛋白约为25 ku。此外,采用细胞病变抑制法检测表明转染后重组细胞表达的IFN-β1具有抗BVDV活性。本研究为梅花鹿IFN-β1蛋白抗病毒分子机制的研究及抗病毒药物的开发奠定了基础。 相似文献
15.
为研究鸭肠炎病毒(DEV)gL蛋白在感染鸡胚成纤维细胞(CEF)过程中的表达情况,本研究以DEVClone-03基因组为模板,应用PCR方法分别扩增得到截短的(gLt,181 bp～711 bp)和全长的gL(1 bp～711 bp)两个基因片段。将gLt基因片段克隆至pET-30a原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化复性,免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗gL蛋白多克隆抗体。同时将全长gL基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA-gL,转染293T细胞。采用获得的抗gL蛋白抗体检测DEV感染CEF后及真核表达质粒pcDNA-gL转染293T细胞后gL蛋白在不同时间点的表达情况。结果表明,在pcDNA-gL转染293T细胞后12 h应用western blot方法能够检测到gL蛋白的表达,其表达量随着转染时间增加而增加;在病毒感染CEF后24 h应用间接免疫荧光方法能够检测到gL蛋白少量的表达,western blot方法在病毒感染CEF48 h后检测到gL蛋白的表达,其表达量随着病毒感染时间增加而增加。上述结果提示,编码gL蛋白基因可能是病毒复制的晚期表达基因。 相似文献
16.
【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号:KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp;pMD19-T-NMBR重组质粒双酶切为2条特异性条带,条带大小分别与pMD19-T质粒和猪NMBR CDS序列片段大小一致,表明成功构建pMD19-T-NMBR质粒;通过双酶切获得线性化的pCD513B-1和NMBR序列;RT-PCR和测序结果表明,成功构建慢病毒过表达载体pCD513B-1-NMBR;pCD513B-1-NMBR转染48 h后,HEK-293T细胞中呈现大量绿色荧光,表明病毒包装成功,病毒效价约为4×106 TU/mL;NMBR基因慢病毒转染猪Leydig细胞48 h后,80%以上细胞有GFP表达,表明大部分细胞成功转染慢病毒;实时荧光定量PCR检测结果表明,转染慢病毒后能够极显著增加NMBR mRNA的表达(P＜0.01)。【结论】本试验成功构建了猪NMBR基因慢病毒过表达载体,并证实猪NMBR基因过表达慢病毒能够增加猪Leydig细胞NMBR基因的表达,为研究NMBR基因过表达在猪Leydig细胞中的作用奠定基础。 相似文献
17.
《中国预防兽医学报》2020,(9)
Sec62/Sec63是位于内质网膜上的跨膜蛋白复合物,辅助新合成的前体蛋白或新生多肽链转运至内质网,进行后期的折叠加工。为研究Sec62/Sec63复合物对乙型脑炎病毒(JEV)复制的影响,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别构建SEC62、SEC63基因敲除的HEK-293细胞系,经测序鉴定以及western blot检测,获得两个基因敲除细胞系,分别命名为SEC62 KO HEK-293细胞和SEC63 KO HEK-293细胞。分别以MOI为1、0.05的JEV感染HEK-293、SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞后,利用间接免疫荧光试验检测Sec62/Sec63复合物对JEV复制的影响。结果显示,不同剂量JEV感染SEC62 KO HEK-293细胞与SEC63 KO HEK-293细胞中荧光信号阳性细胞均少于HEK-293细胞对照组;以MOI为1的JEV感染HEK-293、SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞后,经western blot检测,结果显示于感染后12 h、24 h和48 h,SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞中均未检测出JEV E蛋白条带,而对照HEK-293细胞中JEV E蛋白的表达量逐渐增加。以MOI为1的JEV感染上述3种细胞后检测细胞培养液中病毒滴度,结果显示JEV感染12 h后SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞与HEK-293细胞病毒滴度无差异(p0.05),而感染后24 h与48 h时,SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞培养液中病毒滴度均显著低于HEK-293细胞对照组(p0.01)。以MOI为1、0.5、0.05的JEV感染上述3种细胞后检测48 h后细胞培养液中病毒滴度,结果显示SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞培养液中病毒滴度均显著低于HEK-293细胞对照组(p0.001)。以上结果表明,SEC62、SEC63基因敲除后均抑制了JEV的复制,也表明Sec62、Sec63是影响JEV在细胞内复制的重要宿主因子。本研究为进一步探究Sec62、Sec63等宿主因子对JEV复制的影响机制提供了参考依据。 相似文献
18.
19.
《黑龙江畜牧兽医》2018,(23)
为了构建共表达基因Ⅱ型新城疫病毒(NDV)F、HN蛋白的mcDNA载体,试验采用融合PCR技术将合成的Ⅱ型NDV的F基因片段与HN基因片段融合并携带Flag标签,构建pUC-F-HN-Flag基因片段,然后与mcDNA载体MN512A连接构建重组质粒MN512A-pUC-F-HN-opt-Flag,采用菌落PCR扩增与酶切方法对重组质粒进行鉴定;利用阿拉伯糖诱导剂诱导重组质粒产生mcDNA;将重组质粒转染至HEK-293T细胞中,收集细胞总蛋白并通过Western-blot与间接免疫荧光试验检测蛋白表达情况。结果表明:通过F、HN基因片段的扩增与融合成功构建pUC-F-HN-Flag基因片段,菌落PCR扩增与酶切结果证明重组质粒连接成功,经诱导剂诱导重组质粒成功产生mcDNA,Western-blot及间接免疫荧光试验均检测到目的蛋白。说明重组质粒MN512A-pUC-F-HN-opt-Flag构建成功。 相似文献
20.
为构建禽流感病毒(AIV) H5N1亚型非结构蛋白NS1的真核表达载体,并鉴定其在哺乳动物细胞中的表达与分布,本研究采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒的总RNA中扩增NS1全长基因,并将其克隆于pXJ40中,构建真核表达载体pXJ40-HA-NSl.将该重组质粒转染293T细胞,通过western blot方法鉴定表达的NS1蛋白;并以免疫荧光技术观察NS1在H1299细胞中的分布与定位.Western blot结果显示NS1基因编码蛋白获得表达,免疫荧光检测显示NS1蛋白主要存在于细胞核中.本研究为NS1蛋白功能和H5N1亚型AIV致病机制的研究奠定了基础. 相似文献