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1.
《中国动物传染病学报》2017,(1)
本研究扩增到日本血吸虫Sj TOR完整的蛋白编码区并将其克隆到p XJ40-FLAG载体的HindⅢ、XhoⅠ酶切位点,构建真核表达质粒p XJ40-FLAG-TOR。将测序正确的质粒转染到293T细胞中进行表达,然后应用间接免疫荧光、实时荧光定量PCR、Western blot检测其在293T细胞中的表达情况。测序结果表明Sj TOR蛋白编码区为1245 bp,真核表达质粒p XJ40-FLAG-TOR构建成功。转染293T细胞48 h后,应用间接免疫荧光染色可观察到转染重组质粒的细胞有特异性绿色荧光,空质粒对照则未见。实时荧光定量PCR结果显示,在转染质粒p XJ40-FLAG-TOR 6 h后Sj TOR蛋白的基因已有转录,至转染24 h时转录水平最高,随后开始降低。Western blot结果显示Sj TOR蛋白分子量约53 k Da,可被FLAG单抗和抗Sj TOR-ED1抗血清识别。结果表明Sj TOR蛋白可以在293 T细胞中表达,为进一步研究Sj TOR蛋白的生物学功能和DNA疫苗打下了基础。 相似文献
2.
《甘肃畜牧兽医》2021,51(9)
目的:构建H7N9亚型禽流感病毒NS1基因真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的蛋白。方法:提取H7N9亚型禽流感病毒分离株总RNA,RT-PCR扩增获得NS1的全长基因,克隆至真核表达载体pRK中构建pRK-FLAG-NS1,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到293T细胞中,Western blot技术鉴定NS1蛋白的表达。结果:成功克隆了NS1全长基因,构建了H7N9毒株的NS1蛋白真核表达载体pRK-FLAG-NS1并转染于293T细胞中。结论:Western blot分析表明,NS1蛋白得到成功表达,为开展流感病毒蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。 相似文献
3.
Tetherin是新发现的具有限制多种病毒从细胞膜释放功能的细胞蛋白。本研究采用RT-PCR技术从恒河猴巨噬细胞中扩增Tetherin基因,将其插入真核表达载体pEF4/myc-His B中构建重组质粒pHF-Tetherin。并将其转染293T细胞,通过western blot和激光共聚焦分析Tetherin在293T细胞中的表达及亚细胞定位。将pHF-Tetherin分别与马传染性贫血病毒(EIAV)或猴免疫缺陷病毒(SIV)假病毒粒子感染性质粒共转染293T细胞,分析Tetherin对EIAV及SIV出芽的限制作用。研究结果表明,pHF-Tetherin转染293T细胞48 h后可以检测到Tetherin的表达并定位于细胞膜,而且该蛋白具有抑制EIAV及SIV从转染细胞中出芽的生物学功能。 相似文献
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猪Mx1基因的克隆表达及抗病毒活性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
本文应用(RT-PCR)技术,从猪瘟弱毒疫苗和Poly:IC共刺激7 h的PK15细胞的cDNA中扩增出编码Mx1蛋白的全长基因,并通过引物设计填补了PK(15)细胞系Mx1 cDNA序列中3’端11bp的缺失,成功获得Mx1完整基因的克隆。构建了重组表达质粒pRetroQ-sMx1,转染HEK293T细胞并表达Mx1蛋白,利用微量细胞病变抑制法测定其抗病毒活性。双酶切鉴定和核酸序列测定证实pRetroQ-sMx1真核表达质粒构建成功,转染HEK 293T细胞后,能够检测到绿色荧光,Western blot证实为目的蛋白。微量细胞病变抑制法测定重组蛋白具有一定的抗水疱性口炎病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒的活性。重组Mx1具有一定抗病毒生物功能,为进一步研究重组Mx1蛋白的活性以及Mx1抗病毒药物奠定了基础。 相似文献
5.
为构建禽流感病毒(AIV) H5N1亚型非结构蛋白NS1的真核表达载体,并鉴定其在哺乳动物细胞中的表达与分布,本研究采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒的总RNA中扩增NS1全长基因,并将其克隆于pXJ40中,构建真核表达载体pXJ40-HA-NSl.将该重组质粒转染293T细胞,通过western blot方法鉴定表达的NS1蛋白;并以免疫荧光技术观察NS1在H1299细胞中的分布与定位.Western blot结果显示NS1基因编码蛋白获得表达,免疫荧光检测显示NS1蛋白主要存在于细胞核中.本研究为NS1蛋白功能和H5N1亚型AIV致病机制的研究奠定了基础. 相似文献
6.
Viperin是一种细胞内抗病毒蛋白,可以被I型干扰素、多聚I:C、脂多糖及多种病毒诱导表达,在细胞内主要定位在内质网和脂滴,具有广谱的抗病毒功能。为研究马Viperin(eViperin)在抗病毒感染中的作用,本研究应用RT-PCR从马巨噬细胞中扩增eViperin基因,并将其克隆于真核表达载体pDC315中构建重组质粒pDC-eViperin-Flag,将重组质粒转染293T细胞,western blot检测结果表明eViperin在293T细胞中正确表达。将该重组表达质粒与表达马传染性贫血病毒(EIAV)Gag前体蛋白(Gag precursor,Pr55gag)的表达质粒共转染293T细胞,转染48 h后western blot检测,结果显示实验组细胞培养上清中的Pr55gag含量显著低于空白对照组,表明eViperin具有抑制EIAV释放的作用。此外,将该重组表达质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1,E3Cre共转染HEK293细胞,进一步构建拯救出表达eViperin的重组腺病毒,为研究eViperin的抗病毒功能研究奠定了基础。 相似文献
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为研究嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1对宿主细胞内蛋白表达的影响,并初步分析Ats-1对宿主细胞剪接体的调控机制,本研究将嗜吞噬无形体的Ats-1基因克隆后连接至pcDNA3.1质粒,构建pcDNA3.1-Ats-1重组质粒,经PCR和测序鉴定正确后利用脂质体LipofectamineTM3000将其转染HEK293T细胞,继续培养至24 h、48 h时经western blot鉴定,结果显示,在48 ku (全长蛋白)和35 ku (成熟蛋白)出现特异性条带,表明Ats-1蛋白在细胞内可正确表达;且相较于24 h,48 h Ats-1蛋白在细胞内的表达量显著增加(P<0.05)。将重组质粒pcDNA3.1-Ats-1和空质粒pcDNA3.1分别转染HEK293T细胞,48 h后收获细胞并裂解取裂解液,利用同量异位标签定量蛋白质组学方法(iTRAQ)筛选Ats-1表达后宿主细胞内差异显著表达的蛋白,并采用基因本体论(GO)分析差异显著表达蛋白的功能,利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库分析差异显著表达蛋白参与的信号通路。从剪接体通路选取34个差异表达... 相似文献
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猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显著增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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为研究禽流感病毒(AIV)H5亚型同义Consensus HA(Cons-HA5)基因的重组表达质粒在体外的表达情况,本研究通过对从NCBI流感数据库中获得的5000条H5亚型AIV的HA蛋白的序列比对、分析获得一条同义HA蛋白,将其相对应的核苷酸序列进行鸡体偏嗜性密码子优化,人工合成Cons-HA5基因并克隆于真核表达载体pCAGGS中构建重组表达质粒pCACons-HA5。将重组质粒转染293-T细胞,在激光共聚焦显微镜下观察转染后不同时间HA蛋白的表达情况,同时在转染后24 h、48 h后分别进行表达蛋白的western blot检测。结果表明,pCACons-HA5转染293-T细胞后,其表达的HA蛋白先分布于细胞质中,而后转移至细胞膜表面;westernblot鉴定结果表明,Cons-HA5重组蛋白可以与AIV多克隆血清反应分子量约为70 ku。该重组质粒的构建将为进一步Cons-HA5核酸免疫对H5亚型不同抗原群AIV的交叉保护免疫效力研究奠定基础。 相似文献
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为构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白P27慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞LMH中的表达,试验以实验室前期构建的pcDNA3.1-p27为模板,扩增p27基因,克隆入pLVX-IRES-ZsGreen1载体,构建的重组质粒命名为pLVX-p27,与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染至HEK293T细胞,包装获得表达p27基因的重组慢病毒。将慢病毒上清感染293T和LMH细胞,检测细胞中p27基因的转录水平和蛋白表达水平。结果显示:重组质粒pLVX-p27构建正确,收集的慢病毒上清滴度为9×104TU/mL;实时荧光定量PCR、Western blot和共聚焦荧光试验结果显示P27蛋白主要定位于胞浆,p27基因的RNA和蛋白表达量在感染后96 h内随着感染时间延长逐渐升高。研究表明:表达p27基因的慢病毒包装成功,并且能感染293T及禽源LMH细胞,为进一步研究P27的生物学功能提供了工具。 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2基因真核表达载体的构建及在293T细胞中表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(Eimeria tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2)基因的重组质粒pCAGGS-EtRON2,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其核心编码区的一部分,将其克隆至pGEM-Teasy载体,构建pGEM-Teasy-EtRON2质粒,双酶切出目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核表达质粒pCAGGS-EtRON2。该重组质粒经酶切和测序鉴定后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtRON2基因的表达情况。所构建的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2经过双酶切鉴定,可见一条大小约为1172 bp的目的条带,测序结果与GenBank所登录序列完全一致;免疫印迹实验可见大小约为43 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到特异性红色荧光。研究结果表明已成功构建了EtRON2的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtRON2的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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【目的】 设计构建分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 并评估表达的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性, 为猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】 利用PCR方法扩增E2-GM-CSF基因并克隆入慢病毒表达载体pCDH, 将得到的重组慢病毒质粒pCDH-E2-GM-CSF包装成E2-GM-CSF慢病毒颗粒, 转导HEK293T细胞, 经嘌呤霉素加压筛选获得分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 纯化表达的E2-GM-CSF融合蛋白经小鼠免疫试验验证其免疫原性。【结果】 pCDH-E2-GM-CSF质粒经酶切鉴定, 得到大小分别为8 172 bp的载体片段和1 521 bp的E2-GM-CSF基因片段, 表明E2-GM-CSF基因成功克隆入pCDH载体; 细胞基因组DNA PCR扩增结果为一条大小为1 686 bp的条带, 表明E2-GM-CSF基因成功整合至HEK293T细胞基因组; Western blotting分析获得约70 ku的条带, 证明E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中成功分泌表达; SDS-PAGE验证显示, 纯化后的E2-GM-CSF融合蛋白为单一条带, 纯度较高, 大小约70 ku; 小鼠免疫血清ELISA检测结果表明, 表达的E2-GM-CSF融合蛋白具有良好的免疫原性, 免疫后第14天在小鼠血清中检测到效价为1∶300的E2特异性抗体, 免疫后第21天E2特异性抗体效价达1∶900, 免疫后第28天小鼠血清中的E2特异性抗体效价最高达到1∶8 100, 远高于E2蛋白的1∶1 800。【结论】 利用慢病毒载体构建的表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞可正确分泌表达具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白, 为CSFV的防控提供了新的候选亚单位疫苗, 同时其构建、开发与评估过程也可为其他亚单位疫苗在哺乳动物细胞中的快速表达提供借鉴。 相似文献
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从组织病料中提取CAV核酸,根据GenBank上发表的序列设计两对引物,分别扩增出vp1的139 bp～83 bp和547 bp～1337 bp两个基因片段,然后分别将其充隆到原核表达载体PMXB10上,经PCR和酶切鉴定,证明成功构建了重组表达载体PMXB10-vp1C和PMXB10-vp1D。在0.3 mM的IPTG诱导下,融合蛋白在大肠杆菌ER（2566）以分泌型得到大量表达,经大量表达后,用几丁质柱挂柱切割纯化后,得到切割蛋白E、F,在Western blot免疫分析印迹中,两组融合蛋白和切割蛋白与CAV阳性血清均能发生特异性反应。用ELISA方法检验,纯化的两组蛋白与CAV阳性血清均能发生特异性反应。用两组蛋白免疫SPF鸡后,用全病毒ELISA试剂盒检测血清呈阳性,表明两组蛋白均可诱发机体产生抗CAV的抗体。 相似文献
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为获得293T细胞表达的ALV-J gp85蛋白,研究通过PCR扩增ALV-J gp85基因,利用基因克隆技术克隆pMD-18T-gp85并测序,进而构建表达质粒p EGFP-N1-gp85。利用293T细胞对重组表达质粒进行表达,通过荧光显微镜和Western blot检测重组表达质粒(pEGFP-N1-gp85)的表达情况。结果显示,pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中均匀分布,说明pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达;pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达的蛋白质分子质量约为60 ku。结果表明,成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-gp85,并在293T细胞中获得了表达,为研制ALV-J-gp85 DNA核酸疫苗提供了科学支撑。 相似文献
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以本实验室获得的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株US区基因序列(GenBank登录号EU714267)为基础PCR扩增出gD基因胞外区(gDw),将其定向克隆至原核表达载体pET-30a(+)并转化至大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLys。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明gD基因胞外区在大肠杆菌中获得与预期大小相符的表达蛋白。重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,血清琼扩效价达1∶16,噬斑减数中和试验测定血清中和抗体效价达1∶64。通过免疫荧光技术首次对gD进行亚细胞定位检测,结果表明DEV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)后4h近核区域细胞质内首先开始出现荧光,12h以后显著增加,明显的点状绿色荧光广泛存在于胞质中。本研究为进一步开展DEV gD的功能研究提供了重要数据和材料。 相似文献
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为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的重组马立克氏病毒(MDV),本研究采用RT-PCR方法从NDV强毒株F48E9基因组中扩增出病毒的融合蛋白F基因,构建由CMV启动子和BGH polyA组成的2.7 kb F基因表达盒。将其插入带有黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)和MDV US2同源臂的中间转移载体pUAB-gpt中获得重组MDV转移载体pUAB-gpt-wF。将该转移载体与MDV-814疫苗株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)总DNA共转染CEF,经同源重组及gpt选择系统筛选,获得带有F基因表达盒的重组MDV(rMDV814-wF)。其体外增殖与亲本病毒没有差异。经间接免疫荧光试验、PCR、Southern-blot及western blot等试验证明,重组病毒在CEF中传至13代以上仍稳定表达NDV的F蛋白。该重组病毒的构建为MDV活载体疫苗的筛选及应用奠定了基础。 相似文献
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利用RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Zhejiang/7/2004(H9N2)(SW/ZhJ7/04)HA基因,测序后将其克隆到真核表达载体pCAGGS上,经酶切分析、PCR鉴定和测序验证,得到重组表达质粒pCAGGS-HA,之后将其转染293T细胞,48h后收集转染细胞样品,进行SDS-PAGE分析,结果显示HA蛋白获得了表达。经Western blot检测,结果表明pCAGGS-HA能够在体外瞬时表达具有免疫学活性的HA蛋白,通过免疫小鼠,对其免疫效果进行了初步研究。 相似文献