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1.
猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。 相似文献
2.
《畜牧兽医学报》2016,(6)
为表达与纯化具有天然构象的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)核衣壳(N)蛋白,并制备其单抗(McAb),本研究在SBV-N基因的N端加入6个组氨酸(6×His)标签后,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac~(TM)1中,构建重组供体质粒pFastBac-His-SBV-N。将pFastBac-His-SBV-N转化DH10Bac E.coli,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-His-SBV-N。将rBacmid-His-SBV-N转染Sf9昆虫细胞制备表达His-SBV-N融合蛋白的重组杆状病毒,借助Ni-NTA琼脂糖纯化重组杆状病毒感染Sf9细胞中的His-SBV-N蛋白。以纯化的HisSBV-N免疫BALB/c小鼠制备McAb,利用ELISA叠加试验检测McAb抗原识别位点的异同,并采用高碘酸钠法对识别不同抗原表位的McAb进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。最终获得了4株识别不同抗原表位的McAb(2A11、2E1、4H11和6E12)并进行了HRP标记;亚型鉴定表明,2A11为IgG1亚型,2E1、4H11和6E12均为IgG2b亚型;间接免疫荧光试验证实,4株McAb均能够识别稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系;Western blot进一步表明,HRP标记的4株McAb均与His-SBV-N蛋白发生特异性反应。His-SBV-N融合蛋白及其McAb的成功制备,为施马伦贝格病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。 相似文献
3.
旨在通过慢病毒表达系统构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) N蛋白的Marc-145细胞系。以PRRSV SH1株感染性克隆质粒为模板，通过PCR扩增N基因，并将其克隆到慢病毒载体中，获得重组慢病毒质粒pSin-Ires-Puro-N,将重组质粒pSin-Ires-Puro-N与辅助质粒psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev共转染293T细胞进行慢病毒包装，获得表达N蛋白的重组慢病毒颗粒并将其感染Marc-145细胞，嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，筛选几代后的细胞采用有限稀释法和终点稀释法获得稳定表达N蛋白的Marc-145细胞系。通过PCR鉴定表明细胞系中存在N蛋白基因，通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验验证N蛋白能在细胞系中能稳定表达。本研究成功构建了稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系，为研制PRRSV新型复制缺陷型疫苗奠定基础。 相似文献
4.
本试验旨在构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因重组表达载体,并建立稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系。利用RT-PCR方法扩增Asia 1型FMDV的cDNA,获得VP2基因完整的编码区,构建可表达VP2的带有绿色荧光蛋白标记基因的pIRES2-EGFP-VP2重组表达载体。经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染293T细胞,通过Western Blot技术检测VP2蛋白的瞬时表达;然后再转染BHK-21细胞,通过G418筛选,形成单克隆细胞系,经荧光筛选到表达EGFP的抗性单克隆细胞,扩繁培养克隆细胞,再通过West-ern Blot技术检测其VP2的表达,最终筛选到稳定表达FMDVVP2基因的BHK-21细胞系。结果表明,VP2基因重组表达载体pIRES2-EGFP-VP2构建正确,能够在293T细胞内瞬时表达;转染BHK-21细胞,经G418筛选到表达VP2基因的BHK-21细胞克隆,经长达60d的传代,获得了稳定表达VP2基因和EGFP的BHK-21细胞系。上述结果表明,我们建立了稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系,为进一步探讨VP2基因在FMD... 相似文献
5.
信号淋巴激活分子(SLAM)又称为CD150,是小反刍兽疫病毒(PPRV)和犬瘟热病毒(CDV)等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥重要作用。为建立稳定表达山羊SLAM(g SLAM)的真核细胞系,本研究将人工合成的g SLAM基因克隆至真核表达质粒p IRESpuro3中,并在该基因的3'端引入Flag标签序列作为分子标记,构建了重组质粒p IRES3-g SLAM。将该重组质粒转染BHK-21细胞,经嘌呤霉素加压筛选及采用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组PPRV病毒(r PPRV/GFP)感染鉴定后,筛选到稳定表达g SLAM基因的细胞系。r PPRV/GFP感染和western blot鉴定表明,无论是否有嘌呤霉素压力的存在,该细胞系在传代至第20代,仍能稳定表达g SLAM蛋白。由于g SLAM氨基酸序列与犬的同源性较高,以表达GFP重组CDV强毒株(r CDV/GFP)感染该细胞系,病毒可以感染且能形成明显的细胞病变,表明该细胞系可用于CDV强毒分离和致弱机制等相关研究。 相似文献
6.
稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞系的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
为建立能稳定表达T7RNA聚合酶(T7RNAP)的BHK-21细胞系以研究RNA重组疫苗,本研究从BL21(DE3)大肠杆菌中扩增T7 RNAP基因,定向克隆于质粒pcDNA3.1(+)中,经双酶切及测序鉴定,获得阳性重组质粒pcDNA3.1-T7 RNAP。用该质粒转染BHK-21细胞,经G418筛选14d后获得阳性细胞株。RT-PCR和western blot检测结果表明,建立了稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞系,并且在不同代次的阳性细胞中能稳定表达目的基因和蛋白,该研究为RNA病毒感染性质粒在细胞内转录及病毒拯救技术平台的建立奠定了基础。 相似文献
7.
通过PCR方法分别从含有猪圆环病毒2型(PCV-2)核衣壳蛋白(Cap)基因和猪,γ-干扰素(PoIFN-γ)基因的重组克隆载体pMD18-PCV-2Cap和pMD18-PoIFN-γ中扩增出Cap和PoIFN-γ的基因,将两基因亚克隆到真核表达载体pBudCE4.1中,构建重组真核双表达载体pBud-IFNPCV。重组质粒转染BHK-21细胞后进行Zeocin~(TM)抗性筛选建立细胞系,阳性细胞通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测cap和PoIFN-γ在BHK-21细胞中的表达。结果显示,试验中筛选出1株Zeocin~(TM)抗性阳性BHK-21细胞,cap和PoIFN-γ均在该细胞中获得稳定高效表达,这将为猪圆环病毒病的防治提供新的方法。 相似文献
8.
为建立稳定共表达乙型脑炎病-毒(JEV)完整M前体蛋白(prM)和E蛋白的BHK-21细胞系,本研究在prM蛋白furin蛋白酶剪切位点编码基因中引入突变,将突变后的prM基因克隆于质粒中构建重组表达质粒pCAG-JEV-prM(R89A)E.将重组质粒转染BHK-21细胞,转染48 h后细胞用含G418的选择性培养基选择培养,进一步经细胞克隆纯化制备表达剪切位点突变的JEV prM-E蛋白的稳定细胞系.经IFA和western blot鉴定表明,该细胞系能表达JEV prM与E蛋白,所表达的prM蛋白未发生剪切;细胞经多次传代后仍能够稳定地共表达prM与E蛋白.该细胞系的建立为研究prM蛋白剪切对JEV粒子形成的影响以及亚单位疫苗的制备奠定了基础. 相似文献
9.
10.
为构建表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒(SVA),本研究在感染性cDNA克隆p SVA-I212V/S460L的基础上,采用重叠延伸PCR扩增Strep-tag II并采用无缝克隆法将其插入SVA VP1基因C端,构建感染性cDNA克隆,命名为p SVA-Strep,并采用双酶切和测序鉴定正确后,将p SVA-Strep转染BHK-21细胞拯救重组病毒,收集病变细胞上清,并将含有病毒的细胞上清和野生型SVA(SVA-WT)分别感染BHK-21细胞,以未感染病毒的BHK-21细胞作为阴性对照,感染后24 h分别以鼠源SVA VP2蛋白单克隆抗体(MAb) 5D10 (1∶1 000)、鼠源Strep-tag II MAb (1∶2 000)作为一抗,以FITC标记的山羊抗小鼠Ig G (1∶2 000)为二抗,采用间接免疫荧光试验(IFA)对重组病毒鉴定。IFA结果显示,以鼠源SVA VP2蛋白MAb 5D10为一抗,SVA-WT和重组病毒感染的细胞均出现绿色荧光,以Strep-tag II MAb作为一抗时,仅有重组病毒感染的细胞出现绿色荧光,经SVA-WT感染的BHK-2... 相似文献
11.
为建立稳定表达层黏连蛋白受体(LamR)RK13细胞系(RK13-LamR),并研究LamR蛋白在兔出血症病毒(RHDV)与宿主细胞结合中的作用,将完整的LamR序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-m Cherry,并将该重组质粒pLVX-m Cherry-LamR与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG共转染293T细胞,在293T细胞中包装成含目的基因的重组慢病毒。将收获的重组病毒感染RK13细胞,经过嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法,筛选出表达LamR蛋白的RK13细胞。通过间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting证明所获细胞株能够稳定表达LamR蛋白,将细胞株命名为RK13-LamR。以纯化的RHDV接种RK13-LamR细胞,IFA检测结果显示,LamR蛋白能促进RHDV对RK13细胞的吸附。本研究建立了RHDV相对敏感的细胞株,证实在RHDV吸附宿主细胞的过程中,LamR蛋白起到一定的作用。 相似文献
12.
为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）核衣壳（N）蛋白的非洲绿猴肾（Vero）细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。 相似文献
13.
《中国预防兽医学报》2017,(6)
为构建表达绿色荧光蛋白(GFP)的复制缺陷型西尼罗病毒(WNV),本研究参考NY99株WNV基因组序列,分段合成除结构蛋白基因外的其它基因组序列,以及插入缺失的结构蛋白基因位置的gfp报告基因序列,并按WNV基因组顺序克隆于pCI-neo载体中,构建含有GFP基因的WNV复制子重组质粒pWNVrep-GFP;同时构建表达WNVC蛋白的重组质粒pCAG-WNV-C。将pWNVrep-GFP和pCAG-WNV-C共转染稳定表达WNVprM-E蛋白的W-92细胞系进行WNV粒子包装及病毒粒子拯救。结果显示转染细胞能够表达GFP,将转染细胞培养液接种BHK-21细胞后,能感染细胞并且表达GFP,westernblot可以检测到分子质量为42ku的NS1蛋白条带。然而,感染BHK-21细胞的培养液不能再感染BHK-21细胞,表明拯救的病毒只具有一次感染能力,为复制缺陷型病毒。WNV阳性血清能中和拯救病毒对BHK-21细胞的感染,该复制缺陷型病毒为WNV中和抗体检测和疫苗评价提供了相关的技术平台。 相似文献
14.
《中国兽医学报》2016,(12):2035-2041
为了研究牛干扰素诱导跨膜蛋白3(bIFITM3)对O型口蹄疫病毒(FMDV)的抑制作用,本试验将表达bIFITM3的重组质粒pLV-bIFITM3和表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的对照质粒pLV-EGFP分别转染BHK-21细胞,通过嘌呤霉素抗性筛选获得能够稳定表达外源基因的细胞系。用O型FMDV感染稳定细胞系,通过观察细胞病变、噬斑分析和实时荧光定量PCR方法评价bIFITM3对O型FMDV感染的抑制作用。结果表明,成功筛选获得稳定表达bIFITM3与EGFP的BHK-21细胞系,bIFITM3表达后显著抑制FMDV感染BHK-21细胞,且抑制作用在病毒感染循环的早期阶段就已显现。本试验证明bIFITM3在FMDV感染中具有抗病毒作用,为口蹄疫的防控研究提供新的思路和理论依据。 相似文献
15.
构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞系(LMH)中的表达情况,以探讨p15基因对病毒复制、免疫信号通路的影响。以真核表达质粒pCAGGS-p15为模板扩增p15全长基因,经双酶切后克隆到慢病毒载体plvx-IRES-ZsGreen1上,构建成plvx-p15-Flag慢病毒表达质粒,将该质粒与辅助质粒共转染293T细胞产生慢病毒,将细胞上清中的病毒感染LMH细胞,检测p15蛋白表达情况。慢病毒载体在293T细胞上包装完成后,病毒滴度为2.25×105 TU/mL。慢病毒感染LMH细胞,基因和蛋白水平检测结果表明,p15蛋白表达良好。表达ALV p15基因的慢病毒包装成功,并且能够感染鸡源LMH细胞。该载体的构建为进一步研究p15蛋白的生物学功能提供工具。 相似文献
16.
参照NCBI公布的施马伦贝格病毒(SBV)的N基因开放阅读框序列,设计了一对含特异性酶切位点的引物,扩增SBV N基因,将其克隆于昆虫杆状病毒表达载体p Fast Bac HTB,然后以该重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N,将该重组穿梭质粒在脂质体介导下转染Sf 9昆虫细胞,得到表达SBV重组N蛋白的杆状病毒。通过SDS-PAGE和Western blot对重组N蛋白进行鉴定,表明该蛋白得到表达。本研究为以SBV核蛋白为基础的相关检测方法的建立提供了物质基础。 相似文献
17.
《中国动物传染病学报》2017,(4)
SAMHD1作为宿主的天然免疫限制性因子,参与机体的天然免疫调控,在机体抗病毒感染过程中发挥重要的作用。为了建立稳定表达猪SAMHD1的细胞系,本研究将猪SAMHD1全长编码基因克隆至慢病毒载体pWPXL,构建重组质粒pWPXLpSAMHD1。将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染MARC-145细胞,经嘌呤霉素筛选后,获得表达猪SAMHD1基因的MARC-pSAMHD1细胞系。经检测发现,该细胞系传至10代,仍能稳定表达猪SAMHD1蛋白。该细胞系的建立为猪SAMHD1抗病毒特性和猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理等研究奠定了坚实的基础。 相似文献
18.
旨在构建稳定表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)E165R蛋白的PK 15细胞系。ASFV E165R基因经PCR扩增连接到p3×FLAG-CMV-10载体，再由同源重组连接克隆到慢病毒载体得到重组质粒V2-FLAG-E165R。在HEK 293T细胞中进行慢病毒包装得到慢病毒颗粒并转导至PK 15细胞中，经嘌呤霉素初筛得到的多克隆细胞，接着以终点稀释法筛选获得稳定表达E165R蛋白的单克隆PK 15细胞系。通过PCR扩增、Western blot和间接免疫荧光鉴定构建的PK 15细胞系，进一步利用RT-qPCR技术检测NF-κB及炎症相关基因P65、IKBa、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平。结果表明，稳定过表达ASFV E165R蛋白的PK 15稳定细胞系构建成功，与对照细胞系相比，E165R蛋白显著增强NF-κB以及炎症相关基因IL-6、IL-8和TNF-α的基因表达。本结果为后续研究ASFV E165R对先天免疫信号通路的影响提供生物材料。 相似文献
19.
《中国兽医学报》2016,(2):249-251
为了建立ERβ1293的稳定表达细胞系,为ERβ1293的功能研究奠定基础。以重组质粒pEGFG-N1-ERβ1293为模板,扩增出全长ERβ1293,经胶回收纯化后连接到pMD18-T Vector,经测序鉴定后双酶切连接至Lenti-OE-Flag载体,重组质粒经PCR、双酶切、测序鉴定;使用HEK-293T包装细胞系,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液感染HEK293细胞,利用Puromycin加以筛选,获得稳定表达细胞系,并采用Western blot方法验证基因表达情况。结果获得了Lenti-OE-Flag-ERβ1293重组质粒,并成功包装成慢病毒。利用病毒感染HEK293细胞后获得了稳定表达细胞系,Western blot方法证实,稳定表达细胞系可以成功表达ERβ1293蛋白,为研究ERβ1293的功能奠定了基础。 相似文献
20.
《中国动物传染病学报》2015,(2)
为了构建稳定表达兔岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase,FUT2)的RK13细胞系,本研究将FUT2基因编码序列插入到慢病毒载体p LOV-GFP-3Flag中,构建了p LOV-3Flag-FUT2重组质粒。将p LOV-3Flag-FUT2与包装质粒ps PAX2和外膜质粒p MD2.G共转染293T细胞,获得重组病毒样颗粒。用含病毒样颗粒的细胞培养上清液感染RK13细胞,并通过嘌呤霉素筛选、纯化,获得稳定表达FUT2的细胞系,命名为RK-FUT2细胞。连续培养10代后,利用PCR、RT-PCR和Western blot方法鉴定,结果表明,RK-FUT2细胞系能够稳定表达兔岩藻糖基转移酶。该细胞系为研究FUT2在兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)感染过程和致病机制中的作用提供了有力工具。 相似文献