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抗猪肺炎支原体特异性P36蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
表达P36基因的重组菌BL21(6P-1-P36)经诱导表达,超声波裂解后高速离心,分别收集上清和沉淀。可溶性表达产物亲和层析纯化后用于单抗筛选;同时,用GST-P36包涵体抗原腹腔注射免疫BALB/c小鼠(400μg/只)。利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得了1株能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株5A7-2。生物学特性鉴定表明,腹水单抗的间接ELISA效价为1∶2.5×106;免疫球蛋白亚类为IgG2a。免疫印迹结果显示,腹水单抗能与GST-P36融合蛋白反应而不与谷胱苷肽转移酶(GST)反应,并且在猪肺炎支原体(Mycop lasma hyopneumoniae,Mhp)蛋白36000位置也有明显的条带,说明5A7-2所分泌的是针对MhpP36蛋白的单抗。P36蛋白是Mhp种特异性蛋白,其单克隆抗体的制备,为Mhp种特异性检测方法的建立奠定了基础。 相似文献
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以禽流感H5亚型病毒分别免疫BABL／C小鼠，取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用血凝抑制试验(HI)和间接ELISA检测细胞上清液，结果获得了3株抗禽流感H5亚型病毒特异性单克隆抗体，分别命名为186，1D4，7D1；其中1D4株为抗禽流感H5亚型病毒血凝素特异性单克隆抗体细胞株．186株和7D1株为针对禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体细胞株。经3次亚克隆后，100％杂交瘤细胞保持了分泌抗禽流感病毒抗体的能力。这些单克隆抗体小鼠腹水ELISA效价为10^5，HI效价为2^11-12。研究结果表明，所有这些单克隆抗体仅与相应的禽流感病毒株发生特异性反应，而不与鸡新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、鹅副粘病毒等反应。所有这些单抗在禽流感诊断中将发挥重要作用。 相似文献
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以杆状病毒表达系统表达PCV2ORF2重组蛋白为免疫原,旨在获得针对PCV2的特异性单克隆抗体。用Sf9细胞表达PCV2ORF2重组蛋白,通过层析柱和超滤管浓缩法纯化PCV2ORF2重组蛋白。将纯化的PCV2ORF2重组蛋白免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠,3次免疫后,取免疫后小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA筛选,经过3次亚克隆获得4株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,命名为1H9、4C11、5B8和4F12株。IFA和Western blot试验说明,4株杂交瘤细胞分泌的抗体能与ORF2重组蛋白作用。特异性试验表明,4F12株单克隆抗体与猪圆环病毒2型(PCV2KQ22株)发生特异性反应,经抗体亚型鉴定1H9、4C11和5B8 3株亚型为IgG1/Kappa,4F12株为IgG2b/Kappa,1H9、4C11、5B8和4F12株小鼠腹水效价分别为105、104、106和105。表明获得了与PCV2特异性作用的单克隆抗体。 相似文献
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猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体制备与鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
为获得猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白单克隆抗体,选择原核表达的重组gE蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,将其脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,结果获得了2株能稳定分泌抗PRV gE蛋白的杂交瘤细胞,命名为E3B8和E5C11。间接ELISA检测2株杂交瘤细胞的培养上清液抗体效价为1∶6.4×10~3,腹水的抗体效价分别达到1∶3.28×10~6和1∶6.55×10~6。2株杂交瘤细胞的染色体数分别为105和108。E3B8亚类鉴定重链为IgG1,轻链为κ链;E5C11亚类鉴定重链为IgG2b,轻链为κ链。Western blot检测显示2株单克隆抗体腹水均能与PRV重组gE蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验(IFA)检测显示2株单克隆抗体均能与PRV分离毒株感染的BHK-21细胞发生特异性反应,交叉反应性检测显示2株单克隆抗体与常见病毒不发生交叉反应。表明制备的2株gE蛋白单克隆抗体效价高、特异性强,为gE蛋白结构与功能分析以及PRV免疫诊断试剂盒的开发奠定了基础。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2020,(5)
为了制备能够用于阻断ELISA检测的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)单克隆抗体(MAb),本研究将原核表达的Mhp J株P97蛋白C末端包含R1区的肽段(P97CR1)作为免疫原免疫BALB/C雌鼠,筛选获得一株能稳定分泌抗Mhp P97蛋白MAb的杂交瘤细胞株A3。鉴定结果显示,A3 MAb是IgG1亚类,轻链为κ链。Western blot结果显示A3 MAb能够和原核表达纯化的P97CR1蛋白特异性反应,并且在流式细胞仪分析中能够识别天然的Mhp。通过逐渐截短表达分析该MAb识别的表位序列为LDDNLQ,该抗原表位在Mhp菌株中高度保守。阻断ELISA初步试验结果显示,A3 MAb与蛋白抗原的结合能够被Mhp高免阳性血清阻断。该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的Mhp阻断ELISA检测方法奠定了基础。 相似文献
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为鉴定禽传染性支气管炎病毒(IBV)刺突(S1)蛋白的中和抗原表位，本研究通过IBV全病毒免疫BALB/c小鼠，经融合、亚克隆筛选获得了4株稳定分泌抗IBV S1蛋白抗体的杂交瘤细胞株4A11、1B11、5E5和7C9。经鉴定制备的单克隆抗体腹水抗体ELISA效价为106以上，Western blot和间接免疫荧光试验分析显示该单克隆抗体反应性和特异性良好。随后用8种基于S1分型的IBV毒株为试验毒株，同实验室已有的8株IBV S1单抗(1E9、1H1、1E4、3C6、3C7、2F3、2E5、4F9)共12株单抗进行气管环中和活性检测，发现S1蛋白单抗与8种S1亚型的毒株均有不同程度的中和作用。随后，在抗原表位和Western blot分析的基础上，鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域，获得了6个中和抗原表位，其中除416IQTRTEP422表位，其他5个表位仍未有相关报道。本研究成功制备出4株特异性识别S1蛋白且具有中和活性的单克隆抗体，不仅丰富了IBV的单克隆抗体库，为今后研究IBV S1蛋白分子结构提供了关键生物材料... 相似文献
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《动物医学进展》2020,(7)
以重组的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)PB1-F2的C端蛋白(cPB1-F2)为免疫原制备单克隆抗体,并鉴定其特异性。构建cPB1-F2的pGEX-6p-1原核表达载体,进行蛋白表达与纯化;采用杂交瘤技术制备筛选抗重组cPB1-F2蛋白的杂交瘤细胞株,利用间接免疫荧光和酶联免疫吸附试验筛选鉴定阳性细胞株,并对单克隆抗体特异性进行鉴定。结果显示,纯化的重组cPB1-F2蛋白具有良好的免疫原性,筛选获得了3株稳定分泌抗cPB1-F2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为6F4、2C5和4D3,经鉴定抗体均为IgG1亚类,且3株单克隆抗体均能特异性识别重组PB1-F2蛋白。结果表明成功制备了cPB1-F2特异性单克隆抗体,为研制针对流感病毒的抗体药物奠定了基础。 相似文献
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[目的] 纯化猪塞尼卡谷病毒（Seneca Valley virus，SVV）SVV-CH-HB2016毒株，并制备其结构蛋白VP1、VP2和VP3的单克隆抗体。[方法] 以蔗糖密度梯度离心法纯化的SVV-CH-HB2016病毒颗粒作为抗原，免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行细胞融合。通过间接免疫荧光试验（IFA）结合间接ELISA筛选阳性细胞株，制备能特异性分泌针对结构蛋白的杂交瘤细胞株。采用Western blotting和IFA方法分别检测单克隆抗体与重组表达蛋白及天然结构蛋白的反应性，并对单克隆抗体的病毒中和保护效果进行测定。利用空斑试验和实时荧光定量PCR方法探究中和性单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株吸附过程的影响，最后用抗体相加试验来分析14株单克隆抗体的抗原表位。[结果] 在蔗糖密度梯度为5%~45%（W/V）时获得了纯度较好、浓度较高的SVV-CH-HB2016毒株结构蛋白，免疫小鼠血清抗体效价均达到了1：12 800，成功制备了17株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经验证14株单克隆抗体能与重组结构蛋白发生Western blotting反应，17株单克隆抗体能与病毒发生IFA作用；2G6、4A3和4C11 3株单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株感染的BHK-21细胞具有明显中和保护作用，也能有效抑制SVV-CH-HB2016毒株对293T细胞的吸附。经分析发现，除1F5与2E1、4B8与4F11外，其余10株单克隆抗体分别针对不同抗原表位。[结论] 本研究初步建立了SVV的纯化方法，制备了17株特异性针对SVV-CH-HB2016毒株的单克隆抗体，为后期进一步开展SVV全病毒灭活疫苗的研发、ELISA检测方法的建立及保护性抗原表位的鉴定奠定了基础。 相似文献
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应用鸭胚成纤维细胞(DEF)从曾免疫过CVI988/Rispens株疫苗的患马立克氏病(MD)肿瘤的三黄鸡中分离到一株马立克氏病病毒(MDV,命名为GXY2株。用禽肿瘤病聚合酶链式反应(PCR)鉴别诊断技术对患鸡的肿瘤组织病料及克隆纯化毒株的DEF培养物进行检测,结果均扩增到MDV-1强毒株的132-bpr特异性带和网状内皮组织增殖病病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)。用基于抗MDV-1的gB蛋白单克隆抗体BA4、MEQ蛋白单克隆抗体3G12E6和抗REV的单克隆抗体11B118分别对毒株的培养物进行间接免疫荧光试验(IFA),结果样品只与抗MDV-1的单克隆抗体呈现阳性反应,而与抗REV的单克隆抗体呈现阴性反应。应用PCR技术扩增并测定了毒株的致瘤相关基因meq的核苷酸序列,并与其他MDV-1参考毒株的序列进行比较分析,结果发现其序列与我们之前分离鉴定的MDV-1野强毒株G2和YL040920高度同源。研究的结果表明,分离株GXY2为整合有REVLTR片段的重组MDV强毒株。 相似文献
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以纯化的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白中和表位(SID)重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术获得了6株稳定分泌抗SID区特异性的单克隆抗体细胞株,分别命名为2C4、3G3、5F8、3G5、6E6和3C3。6株杂交瘤细胞诱生小鼠产生的腹水抗体效价分别为1∶51200、1∶6400、1∶12800、1∶6400、1∶51200和1∶25600。免疫球蛋白类型均为IgG1型,轻链均为Κ链。Western blot试验结果显示,6株单克隆抗体均能特异性地识别天然PEDV中的S蛋白。 相似文献
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用基因工程表达的小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)H蛋白免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA方法筛选,获得2株稳定分泌抗PPRVH蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C6和4B10),其细胞培养上清液ELISA效价分别为1:256和1:128,腹水ELISA效价分别为1:128000和1:64000。亚型鉴定表明,2C6和4B10分别为IgG2b和IgG2a。ELISA结果显示,2株单克隆抗体仅与PPRVH蛋白和PPRV反应,不与其它相关病毒反应,表明2株单克隆抗体特异性良好。这2株单克隆抗体的获得为研究PPRVH蛋白生物学特性及建立PPRV免疫学检测方法奠定了基础。 相似文献
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猪肺炎支原体HN株高密度发酵工艺研究及效力评价 《畜牧与饲料科学》2018,39(11):10-15
旨在建立猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）HN0613株高密度发酵工艺技术。以培养滴度（CCU）作为考查指标，确定Mhp HN0613株的最佳活力代次以及复苏培养时间；通过四因素三水平正交试验筛选最佳基础培养基配方；以通气量、搅拌转速和接种百分比作为单因素考查指标，优化15L发酵工艺参变量，并确定700L高密度发酵放大工艺；按照确定的高密度发酵工艺技术，制备MhpHN0613株灭活疫苗，评价其对兔和仔猪的免疫效力。结果表明，Mhp HN0613株F11代较其他代次CCU水平高，可达1×10^9CCU／mL，为最佳活力代次；其在复苏72h后，pH值降为7．0左右，CCU水平达到最高，为1×10^9CCU／mL，为最佳复苏培养时间；培养体系中，2％的初始葡萄糖添加量、8％接种百分比、初始培养基pH值7．6、15％猪血清添加量为最适培养条件；通气量100L／h、搅拌转速300r／min和8％接种百分比条件最有利于Mhp HN0613株15L发酵培养；首次建立了平衡kLa联动pH值回调的工艺技术路线，并将优化后发酵罐搅拌叶轮结构改为推进式叶轮，降低了叶轮对菌体的剪切作用力，CCU较优化前提高了10倍，且培养周期较优化前缩短了2-3d；700L高密度发酵放大工艺中，Mhp HN0613株培养滴度不低于5×10^9CCU／mL．最高可达1×10^10CCU／mL；免疫兔血清抗体效价均不低于1：40，最高可达1：160；免疫组实验仔猪肺炎减少率均高于80％，临床观察精神及食欲未见异常。该研究为Mhp疫苗规模化发酵生产提供了一定的理论依据。 相似文献
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为了建立一种快速检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的方法，试验利用GenBank中ASFV的p72基因(登录号为MK128995.1)序列构建原核重组表达质粒pGEX-6P-1-p72和真核重组表达质粒pCAGGS-myc-p72,通过大肠杆菌原核表达系统获得p72重组蛋白，将其纯化后免疫小鼠，获得阳性杂交瘤细胞，通过Western-blot和间接免疫荧光鉴定筛选单克隆细胞株，并用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定各单克隆抗体的亚型。通过对p72兔源多克隆抗体包被浓度及纯化的3株单克隆抗体稀释度进行优化，初步建立检测ASFV的双抗体夹心ELISA方法，并用该方法测试纯化的3株单克隆抗体分别与p72兔源多克隆抗体两两组合后所能检测的p72重组蛋白的灵敏度。结果表明：p72重组蛋白大小为99 ku;以纯化的原核表达的p72重组蛋白作为抗原免疫3只小鼠，抗体效价均大于1∶10 000;经细胞融合、克隆和筛选共获得5株阳性杂交瘤细胞，将其分泌的单克隆抗体分别命名为2C4C8、2C4B8、5C11F11、5C11D12、7D10C9,5株单克隆抗体与真核... 相似文献
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针对小反刍兽疫病毒核蛋白制备特异性的单克隆抗体,并对其进行生物学特性鉴定和初步应用。以纯化的Bacmid-PPRV-N重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的致敏脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合,获得单克隆抗体,并通过染色体技术等方法研究其生物学特性,将其作为竞争单抗,Bacmid-PPRV-N重组蛋白作为检测抗原建立竞争ELISA检测方法。结果表明:经克隆和间接ELISA筛选,获得了2株能稳定分泌抗小反刍兽疫病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5B11和3H10-3B8。生物学特性鉴定试验表明:5B11和3H10-3B8抗体类型和亚类均为IgG2b;5B11单抗腹水的效价达1∶819 200,3H10-3B8达1∶12 800;血清学试验证明2株单抗均能与Bacmid-PPRV-N重组蛋白抗原结合,具有高度的特异性;相加ELISA试验结果显示,5B11和3H10-3B8 2株单克隆抗体分别识别N蛋白上不同的抗原位点;2株杂交瘤细胞的染色体均为99～104。应用建立的c-ELISA检测方法对222份血清样品进行PPRV抗体的检测,与参考试剂盒比较得到98.20%的符合率。本研究获得了2株能稳定分泌抗PPRV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以单抗5B11作为竞争抗体建立了PPRV的c-ELISA检测方法。 相似文献
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用基因工程表达的牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白免疫Balb／C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选,获得3株稳定分泌抗BVDVNS3蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株（1A9、2C3和5D5）,其细胞培养上清液ELISA效价分别为1：256、1：128和1：256,腹水ELISA效价分别为1：128000、1：64000和1：128000。亚型鉴定表明,1A9、2C3和5D5分别为IgG1、IgG2a和IgG1、ELISA结果显示,3株单克隆抗体仅与BVDVNS3蛋白和BVDV反应,不与其它相关病毒反应,表明3株单克隆抗体特异性良好。这3株单克隆抗体的获得为建立BVDV免疫学检测方法奠定了基础。 相似文献
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旨在制备禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)中国流行株的fiber2蛋白的特异性单克隆抗体。以纯化的FAdV-4中国流行株CH/HNJZ/2015免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏与SP2/0细胞融合，采用基于fiber2蛋白的间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，经过5次亚克隆，获得2株分泌抗fiber2蛋白抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2C3和7B4。以制备的2C3和7B4腹水进行亚型鉴定、反应原性、特异性以及中和活性测定。结果显示，成功制备了抗FAdV-4 fiber2蛋白的特异性单克隆抗体，获得的单克隆抗体均为IgM亚型，可特异性识别FAdV-4及其fiber2蛋白，为FAdV-4的免疫检测和fiber2蛋白功能研究提供了研究材料。 相似文献
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为制备针对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)P1蛋白的单克隆抗体(McAb),本研究利用重组犬瘟热病毒P1蛋白免疫BALB/c小鼠,并将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,用CDV包被ELISA板,通过间接ELISA法筛选出两株稳定分泌抗CDV-P1的杂交瘤细胞株(E9E4C10、E9F8D9)。间接ELISA检测腹水效价均为1∶106,亚类鉴定结果均为IgG2b。Western blotting和间接免疫荧光(IFA)分析结果表明,两株单克隆抗体均能与重组P1蛋白和CDV发生反应;ELISA叠加试验增殖结果表明,两株单克隆抗体识别的抗原表位不同。本研究制备的特异性抗CDV-P1的单克隆抗体为建立CDV免疫学检测方法和P蛋白的功能研究奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医杂志》2015,(6)
为了制备禽呼肠孤病毒(ARV)σB蛋白的单克隆抗体,以实验室保存的融合蛋白His-σB为免疫原免疫BALB/c小鼠,经过融合、筛选、亚克隆后,获得2株能稳定分泌抗σB蛋白单克隆抗体的特异性杂交瘤细胞株,分别命名为3C3、4H11。经间接ELISA方法测定,2株单抗的亲和力解离常数分别为5.17×10-10和5.04×10-10,均为高亲和力抗体。2株单抗的重链类型分别为Ig G2a和Ig G2b。间接免疫荧光和Western Blot结果分析表明,该两株单抗均能特异性识别ARV感染DF-1细胞后产生的σB蛋白。以Western blot方法利用单抗检测不同截短的σB蛋白,初步确定3C3、4H11两株单抗抗原识别表位分别位于101 aa~120 aa之间和121 aa~140 aa之间。该单抗为检测ARV及研究ARVσB蛋白的生物学功能奠定了基础。 相似文献