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1.
禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)NA基因的克隆及其重组禽痘病毒转移载体的构建 总被引：10，自引：1，他引：9
采用RT－PCR技术扩增了禽流感病毒A／Guangdong/3/96(H5N1)[GD3/96]神经氨酸酶（NA）基因，并将其克隆到pUC18质粒中进行测序。核苷酸序列测定结果为：NA基因全长为1410bp，共编码469个氨基酸，从pUCNA中切下NA基因片段，将其亚克隆到质粒pSY538的EcoR I位点，将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因平端克隆到该质粒的Sma I位点，然后切下同位含有NA及LacZ基因的片段，再亚克隆到禽痘病毒载体pSY681的Not I位点，经限制性内切酶分析，PCR鉴定等，证明含有禽流感病毒NA基因的重组禽痘病毒转移载体已构建成功，从而为进一步筛选表达NA蛋白的重组禽痘病毒及探讨该蛋白的免疫原性鉴定了实验基础。 相似文献
2.
表达新城疫病毒融合蛋白基因禽痘病毒重组体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
通过RT-PCR扩增新城疫病毒F基因,利用禽痘病毒复合启动子、SV40 PolyA终止信号序列构建F基因表达盒。将F基因表达盒与loxp-GFP-loxP序列串联插入禽痘病毒重组臂,构建了禽痘病毒转移质粒载体。在脂质体介导下转染CEF,获得了带有绿色荧光信号的重组病毒rFPVFGFP。通过二次转染,利用Cre-loxP位点特异性重组将重组病毒基因组的GFP自动去除,结果获得了只含新城疫病毒F基因表达盒的重组禽痘病毒rFPVF。试验结果表明,rFPVF复制稳定,表达的F蛋白具有免疫原性,能够刺激鸡只产生抗新城疫病毒的中和抗体。 相似文献
3.
在含痘病毒早晚期启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒侧翼各引入1个loxP序列。以禽痘病毒282E4株作为候选载体,通过同源重组将其插入到病毒基因组的FPV030区域,获得了表达GFP的重组禽痘病毒。然后在Cre酶介导下,利用loxP位点特异性重组剪除了重组病毒基因组中的GFP报告基因。结果表明,以GFP作为筛选标记使重组病毒的构建更为简便,同时利用Cre-loxP系统可以轻松地去除报告基因。这种技术有利于其它抗原性基因重组禽痘病毒的构建。 相似文献
4.
为建立检测鸭痘病毒的TaqMan荧光定量PCR方法,本试验克隆了鸭痘病毒P4b基因,构建重组质粒pMD-DPV-P4b,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的禽痘病毒P4b基因设计合成1对特异性引物及与该引物相匹配的特异探针。以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-DPV-P4b为标准品,通过对反应条件进行优化,建立了一种检测鸭痘病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法与禽流感病毒、鸭黄病毒、鸭肝炎病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒和小鹅瘟病毒等其他水禽病毒,以及山羊痘病毒和鸡痘病毒等其他痘病毒均无交叉反应,特异性好。该方法最低检测限为1.29×102拷贝/μL,比普通PCR检测方法高100倍。组内和组间变异系数均小于2%。结果表明,本试验所建立方法具有灵敏、特异、安全、快速的特点,适用于鸭痘病毒的检测。 相似文献
5.
应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向末端重复序列片段,将其克隆至pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-ITR,再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组菌进行序列测定,并将所得序列与GenBank收录的2株山羊痘病毒、3株绵羊痘病毒全基因序列进行比较分析。结果:所测4个毒株序列与GenBank上收录的山羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为100%,与绵羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为98.3%。研究结果表明,山羊痘病毒反向末端重复序列与已收录的羊痘毒株之间该片段的同源性非常高,为今后兽医临床上应用PCR方法检测羊痘病毒提供了另一更为特异、保守的基因片段。 相似文献
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以GPT和GFP为双重筛选标记的禽痘病毒转移载体的构建及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为研制和开发以禽痘病毒为载体的重组病毒疫苗,本研究构建了禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt,该载体含有gfp和gpt2种报告基因及背对的痘苗病毒晚期启动子P11和早期启动子P7.5,P11启动gfp和gpt两个基因,P7.5用于启动外源基因,在早期启动子P7.5下游引入NotⅡ和AftⅡ两个酶切位点.用于外源基因的插入.为检测禽痘病毒转移载体pSY681-gfp-gpt的有效性,将H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/10/01(H9N2)的HA基因插入到该载体中构建转移载体pSY681-gfp-gpt-HA9,将转移载体转染已感染禽痘病毒S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞,利用gfp和gpt同时进行双重筛选、数轮蚀斑纯化后获得了重组病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,通过PCR、western blot鉴定,结果证明,获得了能稳定表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,为今后重组禽痘病毒活载体疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
8.
《中国预防兽医学报》2018,(12)
为研究表达鹅γ干扰素(GoIFN-γ)基因重组禽痘病毒的抗病毒活性,本研究构建了在禽痘病毒(FPV)早晚期启动子LP2EP2控制下的IFN-γ基因重组禽痘病毒转移载体,将其转染至亲本禽痘病毒S-FPV-017预感染的鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF),使其与禽痘病毒基因组进行同源重组,经过9轮筛选和纯化并进行PCR和间接免疫荧光检测,获得能稳定表达外源基因的重组病毒r FPV-IFNγ-LacZ。利用细胞病变抑制法检测抗病毒活性结果显示,在鸡胚成纤维细胞中重组禽痘病毒表达的IFN-γ对鹅细小病毒的复制具有显著抑制作用。本研究为制备共表达保护性抗原和γ干扰素基因的重组基因工程疫苗研究奠定基础。 相似文献
9.
通过将禽痘病毒接种15日龄鹅胚的绒毛尿囊膜的方法对其进行驯化,使其适应鹅胚,并出现典型病变;再以驯化第9代的病毒接种16日龄雏鹅,通过PCR的方法在接种后10d的鹅血液中检出病毒。根据已发表的禽痘病毒TK基因序列设计1对引物,采用PCR技术扩增出与预期设计的600bp大小相符的TK基因片段,将扩增产物克隆入pMD18-T载体,经酶切鉴定筛选出阳性克隆,进行序列测定和分析。序列分析表明:所扩增的TK基因的核苷酸长度为552bp,,共编码183个氨基酸。同源性分析表明:经鹅胚驯化的FPVTK基因片段与已发表的282E4株FPVTK基因比较核苷酸序列同源性为99.82%,氨基酸序列同源性为99.45%。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2019,(8):1466-1471
旨在对麻鸭源禽痘病毒进行分离鉴定,并对其组织嗜性和易感动物进行初步探索。用荧光定量PCR方法检测广西邕宁发病麻鸭皮肤痘疹样本,结果显示,呈鸭源禽痘病毒阳性;电镜观察负染标本和超薄切片,病毒粒子符合典型的痘病毒形态特征;HE染色镜检组织切片,符合痘病毒感染的病理学特征;利用SPF鸭胚和鸭胚成纤维细胞进行病毒分离,经IFA和PCR方法检测证实成功分离到1株麻鸭源禽痘病毒;对麻鸭15种组织597份样本进行检测,发现痘疹中病毒含量最高,其次为食管、喉头、气管,而在肠道和法氏囊中未检测到病毒;同居感染试验发现麻鸭、阳江鹅和樱桃谷鸭均可感染该病毒,而鸡和番鸭未见感染。结果为鸭源禽痘病毒的生物学特性、组织嗜性和宿主范围研究,以及其诊断和防控提供理论依据。 相似文献
11.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(15)
为了了解广西地区鸭痘病毒的流行情况,试验采用实时荧光定量PCR、基因克隆和序列分析的方法,对采自广西河池市宜州某养鸭场患病鸭的痘斑组织进行病原学检测。结果表明:从痘斑组织中检测出的病毒为鸭痘病毒,将其命名为Hechi株。用自行设计的引物P1/P2扩增出大小约为577 bp的Popr基因片段,与预期大小一致。经MEGA 6.0软件分析,Hechi株属于基因5.1亚群;与国内鸡痘疫苗株(282E4)、广西大新株(daxin)、鹅源毒株(YNE)、鸭源毒株(YNY)的氨基酸位点比较有11个氨基酸位点发生改变,与国外参考株相比有5个氨基酸位点改变较大;与YNE、YNY、282E4、daxin株的核苷酸序列同源性分别为87.4%、87.6%、87.6%和99.8%,氨基酸序列同源性分别为91.9%、92.4%、92.4%和100%。说明目前广西地区流行的鸭痘病毒很可能来源于YNY、282E4这2株毒株。 相似文献
12.
表达猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白重组鸡痘病毒的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
从含有猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核衣壳蛋白（N）的质粒扩增出N基因，构建禽痘病毒转移载体。该载体含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2控制之下的PRRSVN基因、P11启动下的报告基因lacZ以及用于同源重组的禽痘病毒基因组的片段。在转移载体转染亲本病毒S—FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）之后，采用蓝色表型筛选的方法，筛选到表达N基因的重组病毒，并对其进行了6轮蚀斑纯化。PCR方法鉴定证明重组病毒的基因组中含有完整PRRSVN基因，间接免疫荧光试验证明了PRRSVN蛋白在重组病毒感染的CEF细胞中获得表达，本研究为猪繁殖与呼吸综合征非复制型疫苗的研制打下了基础。 相似文献
13.
根据已发表的鸡痘病毒(fowlpox virus,FPV)4 b核心蛋白基因的核苷酸序列设计合成了(P3,P5)1对引物,通过对影响PCR扩增条件的优化,在不同的退火温度下,直接以病毒液为模板扩增出预期的1 107 bp的片段。特异性检测表明,两对引物对FPV102株、FPV282E4(北京)、大华农鸡痘疫苗毒株、重组鸡痘疫苗病毒及临床病料均能扩增出相应的特异性片段,而用鸡马立克氏病毒、传染性支气管炎病毒,鸽痘病毒及鸡胚成纤维细胞制备的模板进行PCR扩增均为阴性。敏感性检测表明,引物能检测0.195 ng/μL的模板量。用此方法检测50份临床样品,其中的阳性率为92%,用琼脂扩散试验方法检测的阳性率为70%。以上结果表明,该方法可以用于FPV临床样品的检测。 相似文献
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为填补国内外水禽源痘病毒培养特性和理化特性研究方面的空白,对国内检测并鉴定的鹅源禽痘病毒,用鸡胚进行分离培养和病毒理化特性研究。将鹅皮肤痘疹样本研磨后,接种SPF鸡胚进行连续传代培养。病理检查和PCR检测证实,病毒可在鸡胚中增殖,且经连续5轮传代后,鸡胚病变及病毒滴度趋于稳定。鸡胚中可以观察到绒毛尿囊膜水肿增厚及白色痘斑等禽痘特征性病变。对采集病变的绒毛尿囊膜进行电子显微镜观察,可见病毒包涵体和典型禽痘病毒粒子。利用建立的鸡胚培养体系,对该病毒理化特性进行鉴定,发现病毒对热(55℃)、酸(pH3)、碱(pH11)、胰蛋白酶、乙醚和氯仿敏感。本研究首次建立了鹅源禽痘病毒鸡胚培养体系并对其理化特性进行了鉴定,从而为系统开展该病毒生物学特性和防控技术研究提供了必要的技术基础。 相似文献
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为构建表达H5亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Anhui/1/06(H5N1)(简称AH/06)HA蛋白的重组禽痘病毒,本研究利用感染-转染的方法通过转移载体pSY681-gfp-gpt将AIV株AH/06的HA基因同源重组到禽痘病毒(FPV)中,并利用gfp和gpt双重筛选标记在鸡胚成纤维细胞中经过多轮筛选,得到纯化的重组禽痘病毒(rFPV-gfp-gpt-AHHA)。通过PCR、序列测定和western blot的方法对rFPV-gfp-gpt-AHHA进行鉴定和抗原活性分析。结果表明AH/06的HA基因稳定的重组到rFPV-gfp-gpt-AHHA中,其表达的HA蛋白能够与AH/06的阳性血清反应,显示出了良好的抗原性。同时病毒的生长曲线也显示外源HA基因的插入并没有影响亲本病毒的复制。这些结果为进一步的免疫效力研究奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2018,(11)
为确诊福建省某规模肉鸽养殖场疑似鸽痘疫情,采集病鸽皮肤痘痂组织,经处理后接种11日龄SPF鸡胚,培养7d后观察到鸡胚尿囊膜增厚,出现典型的白色痘斑。组织学观察可见皮肤表皮增生,形成厚的网状结构,上皮细胞呈不同程度的空泡变性,胞浆内有嗜酸性包涵体,呈红色、圆形或椭圆形;肺脏淤血,肺泡破裂及增殖性支气管炎。待检样本进行鸽痘病毒P4b基因PCR检测,得到特异性条带;根据P4b基因核酸序列构建系统发育树,结果显示分离株与来自美国(KC017965)和南非(KJ801920)的2株鸽痘病毒聚在一起,同源性为100%,与企鹅痘病毒、鹌鹑痘病毒和鸡痘病毒的同源性分别为99.6%,99.6%和91.1%;与金丝雀痘病毒和火鸡痘病毒同源性最低,为73.3%～75.0%。结果表明,本次暴发为鸽痘病毒感染所致,为鸽痘防控及致病机理研究奠定了理论基础。 相似文献
18.
从GenBank上调取猴痘病毒的基因序列,经过分析,找出了猴痘病毒的特异性靶基因序列F3L片段,人工合成猴痘病毒MPV(AF380138)F3L基因片段(48048-48509bp)并插入质粒,作为病毒检测的模拟阳性模板。根据该序列设计并合成PCR引物,对模拟的阳性模板进行扩增,结果能扩增出与目的片段大小一致的条带。建立了PCR检测方法,经条件优化后,对鸡痘、禽痘、羊痘等14种相似病毒核酸进行PCR扩增,发现具有良好的特异性。PCR方法能扩增出0.3pg的阳性模板,显示建立的PCR方法具有高效、快速、特异、灵敏的特点,可用于口岸猴痘病毒的检疫。 相似文献
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将含痘病毒启动子LP2EP2的鸡传染性支气管炎病毒S1糖蛋白基因和鸡IL-18(ChIL-18)基因同时插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组禽痘病毒转移载体pSYS1/ChIL-18。用脂质体将其转染已感染禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达S1和鸡IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-S1-ChIL-18)。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选,对重组病毒rFPV-S1-ChIL-18进行多次蚀斑克隆。以重组禽痘病毒DNA为模板,利用S1基因和鸡IL-18基因特异引物进行PCR,分别扩增出1条约1.7 kb和1条约0.6 kb的带。经间接免疫荧光法和T细胞转化试验证实感染rFPV-S1-ChIL-18的CEF中存在表达的S1和鸡IL-18。 相似文献
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绵羊痘病毒甘肃流行株ORF121基因的克隆及序列分析 总被引：2，自引：1，他引：1
从甘肃景泰疑似羊痘绵羊的皮肤组织中提取基因组DNA,PCR扩增糖蛋白ORF121基因。序列分析表明,该基因由519个核苷酸组成,编码172个氨基酸,分子量为19.9 kua,序列中A+T含量占74.95%,G+C含量仅占25.05%。甘肃景泰株ORF121基因同绵羊痘病毒参考株之间的核苷酸同源性高达99%;与疙瘩皮肤病病毒和山羊痘病毒参考株之间的同源性分别为97%和95.6%。结构预测结果显示,ORF121蛋白具有两个N-糖基化位点和一个跨膜区,且具有极强的亲水性。以上结果表明,ORF121蛋白在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,具有潜在的疫苗或/和诊断价值。 相似文献