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用表达非融合蛋白的原核表达载体ｐＢＶ２２０,通过ＰＣＲ技术的引物设计对ＰＲＲＳ病毒ＢＪ－４株核衣壳蛋白（Ｎ）基因起始密码子上游进行了改造和修饰,在其上游加入了 ＥｃｏＲＩ酶切位点。将 ＰＲＲＳ病毒 Ｎ基因插入载体 ｐＢＶ２２０ ＰＬＰＲ启动子和Ｓ－Ｄ序列下游合适距离的位置,成功地构建了含有ＰＲＲＳ病毒Ｎ基因的原核重组表达载体ｐＢＶ－Ｎ。ｐＢＶ－Ｎ转化大肠杆菌ＤＨ５ａ,经温度诱导后菌体裂解物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现,在约１５ｋＤ处出现一条特异性的目的蛋白条带,分子量大小与ＰＲＲＳ病毒Ｎ蛋白相符,而诱… 相似文献
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牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株的构建 总被引：8，自引：1，他引：7
将含有牛传染性鼻气管炎病毒（ Ｉ Ｂ Ｒ Ｖ） Ｔ Ｋ 基因的片段克隆于ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ Ｋ 中, 再用 Ｂｇ１ Ⅱ和 Ｓａｃ Ｉ切去 Ｔ Ｋ 基因中３４７ｂｐ 的片段, 获得了含缺失 Ｔ Ｋ 基因的重组质粒, 然后插入 Ｌａｃ Ｚ 报告基因, 构建成转移载体。以脂质体转染法将此转移载体与 Ｉ Ｂ Ｒ Ｖ Ｂａｒｔｈａ 株在牛肾细胞（ Ｍ Ｄ Ｂ Ｋ） 上共转染, 经过蓝色蚀斑筛选和蚀斑克隆纯化, 获得了能稳定遗传的重组 Ｉ Ｂ Ｒ Ｖ。经 Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 印迹杂交鉴定, 证实该重组病毒为 Ｔ Ｋ 基因缺失突变株。 相似文献
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鸡贫血病毒山东分离株全基因克隆 总被引：1，自引：1，他引：0
设计了 Ｃ Ａ５、 Ｃ Ａ６ 和 Ｃ Ａ７、 Ｃ Ａ８ 两对引物,分别扩增鸡贫血病毒（ Ｃ Ａ Ｖ）山东分离株 Ｓ Ｊ１ 的 １５ Ｋｂ 和 ０８ Ｋｂ Ｄ Ｎ Ａ 片段。并将这两个片段分别克隆至 ｐ Ｕ Ｃ１１９ 和ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ Ｓ Ｋ＋ ）载体质粒,最后一起克隆到 ｐ Ｑ Ｅ３２ 载体质粒上,使两个片段前后连接成一个全长的病毒 Ｄ Ｎ Ａ。用该质粒转染 Ｍ Ｄ Ｃ Ｃ Ｍ Ｓ Ｂ１ 细胞,经免疫荧光抗体法和 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 检测到 Ｃ Ａ Ｖ 病毒,结果证明我们得到了一个 Ｃ Ａ Ｖ 感染性全基因克隆。 相似文献
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鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的表达 总被引：13，自引：2，他引：11
将含有传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）广东地方分离株Ｄ４１的Ｓ１基因ｃＤＮＡ（从ＡＴＧ到Ｓ前体蛋白裂解位点）的片段克隆到具有多角体启动子（ＰＸＩＶ）和人工合成启动子（Ｐｓｙｎ）的杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，构建了重组转基因载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３－Ｓ１．Ｄ４１。用该重组转移质粒与无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－ＧＤＮＡ（ｏｃｃ－，ｇａｌ＋）共转染草地夜蛾（Ｓｆ９）细胞，筛选并纯化出既能表达Ｓ１基因又能形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＩＢＶＳ１－ｏｃｃ＋（ｏｃｃ＋，ｇａｌ－）。通过间接ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等方法在感染了重组病毒的Ｓｆ９细胞中成功地检测到分子量约６２０００的Ｓ１基因表达产物。虽然该重组Ｓ１糖蛋白可能由于Ｎ－糖基化不完全而分子量小于天然蛋白，但它可以像正常病毒粒子一样，被鸡抗ＩＢＶＤ４１株血清特异识别。 相似文献
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将马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株基因文库中的ＢａｍＨＩＩ３和Ｋ３克隆质粒分别用双酶切消化，获得２．８ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＳａｌⅠ片段和１．１ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩ片段，然后将这２个片段定向克隆于载体ｐＵＲ２２２中，构建了含ＭＤＶ糖蛋白Ｂ（ｇＢ）基因的重组质粒。为了基因操作方便和高效表达，设计了１对带有酶切位点的引物，用ＰＣＲ扩增了ＭＤＶｇＢ基因部分片段，并按正确方向插入去磷酸化的载体质粒中，得到起始密码子前带有ＥｃｏＲＩ酶切位点的ＭＤＶｇＢ基因克隆，再将该基因插入去磷酸化的家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）转移载体ｐＢＦ１４中，ＤＮＡ序列分析确证了克隆基因及阅读柜架的正确性。以重组转移载体与野生型ＢｍＮＰＶ共转染家蚕细胞，用有限稀释法点杂交结合空斑技术纯化重组病毒。用荧光抗体试验检查重组病毒感染的家蚕细胞，可见感染细胞的胞浆及胞膜出现强荧光反应 相似文献
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伪狂犬病病毒鄂A株TK基因的克隆及其鉴定 总被引：6，自引：0，他引：6
合成了 １ 对能对伪狂犬病病毒（ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ, Ｐ Ｒ Ｖ） Ｔ Ｋ（ｔｈｙｍ ｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）基因＋ １１９～＋ １ ０７１区进行特异扩增的引物,用猪 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株细胞培养物提取的基因组作模板,扩增出 ９５３ ｂｐ 长的片段,用地高辛标记该片段作探针,通过 Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ 杂交,从克隆有 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的重组质粒中钓出含 Ｔ Ｋ 基因的重组质粒 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ。对 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ 进行酶切分析,绘制了含 Ｔ Ｋ 基因的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的图谱,通过测序得出了 Ｔ Ｋ 基因的全序列。将该序列与 Ｐ Ｒ Ｖ Ｎ Ｉ Ａ３ 株 Ｔ Ｋ 基因进行比较,发现鄂 Ａ 株的 Ｔ Ｋ 基因存在变异。 相似文献
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含LacZ报告基因的传染性喉气管炎病毒TK基因转移载体质粒的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
在传染性喉气管炎病毒北京Ｅ２株ＴＫ基因克隆,鉴定的基础上,进一步构建转移载体质粒,为ＩＬＴＶ ＴＫ基因缺失毒株的构建作准备,先用ＰｓｔＩ将ｐＳＶ－ｇａｌ线性化,再经ＥｃｏＲｉ不完全酶切,分离含ＳＶ４０立即早期启动子和增强子的４．２Ｋｂ的ＬａｃＺ报告基因片段,并用Ｋｌｅｎｏｗ大片段补平,将克隆ＴＫ基因的载体ｐＴＫ用ＳｎａＢＩ处理,后用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将以上两个片段平端连续成重组质粒,转化 ＪＭ１０９ 相似文献
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禽呼肠孤病毒S1基因的扩增克隆与鉴定 总被引：14，自引：4，他引：10
利用反转录－聚合酶链（ＲＴ－ＰＣＲ）技术,扩增出禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）Ｓ１１３３、１７３３长为５４０ｂｐ的Ｓ１基因片段。将扩增到的２个毒株的Ｓ１基因通过粘端连接分别克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ＋质粒中,用ＰＣＲ和限制性内切酶分析鉴定,表明获得２种重组质粒ＡＲＶ Ｓ１１３３ Ｓ１－ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ＡＰＶ １７３３ Ｓ１－ｐＢｌｕｅｓｃｒｐｔ。 相似文献
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将ＰＲＲＳＶＣＨ１ａ株Ｎ基因用ＥｃｏＲＩ和ＰｓｔＩ双酶切从重组质粒ｐＵＣ１８ＯＲＦ７切下后，插入到原核表达载体ｐＢＶ２２０的ＰＲ、ＰＬ启动子下游，得到重组表达质粒ｐＢＶ２２０ＯＲＦ７。转化了ｐＢＶ２２０ＯＲＦ７的大肠杆菌ＪＭ８３经诱导培养后，用ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达产物。结果表明ＰＲＲＳＶＣＨ１ａ株的Ｎ基因在原核载体上得到高效表达，表达产物占菌体总蛋白的１５３％。表达蛋白可望成为有价值的ＰＲＲＳ诊断抗原。 相似文献
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将来自质粒pFSV40的300bpBamHI/PstI片段[其中含有SV40poly(A)和部分多克隆位点]插入到质粒pUSK相应的酶切位点中，获得重组质粒USKSV40。该重组质粒中gG基因5’端编码区缺失了428bp。将来自质粒pcDNA3.1( )的946bpBglⅡEcoRI片段（其中含CMV启动子及部分多克隆位点）插入到质粒pUSKSV40的BamHIEcoRI位点，构建了通用载体pPRVCMV-uni，其中含有CMV启动子，SV40poly(A)以及NheI,Pme1,BamHI,BstXI,EcoRI,StuI,XbaI等7个单一克隆位点，将eGFP基因插入到该通用载体的BamHI和EcoRI之间，用所获得的转移载体与TK/gG-/LacZ^ PRV基因组共转染PK-15细胞，经检测eGFP基因在重组伪狂犬病病毒中获得表达，从而证实该通用载体的构建是可行的。本研究研制以伪狂犬病病毒为载体的二价或多价基因工程疫苗奠定了物质基础。 相似文献
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为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSV SCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM(deleting M),将其与pMD19-T simple vector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG于37℃诱导,PRRSV M基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35 kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经Western Blot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。 相似文献
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为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSVSCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（deletingM）,将其与pMD19-Tsimplevector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,经IPTG于37℃诱导,PRRSVM基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经WesternBlot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp9基因的克隆与原核表达 总被引：2，自引：0，他引：2
通过PCR方法从重组质粒pSK-B2扩增得到非结构蛋白Nsp9的基因片段。将基因克隆至原核表达载体pET-28a( ),得到重组表达载体pET-28-Nsp9,转化Escherichia coliBL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白的分子量约为27.3 kD,表达量占菌体蛋白的43.2%。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。 相似文献
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PCR扩增invA基因特异性检测沙门氏菌 总被引：14，自引：2，他引：12
建立了扩增invA基因检测沙门氏菌的PCR方法。对收集的50个血清型123株沙门氏菌及7种27株非沙门氏菌进行PCR,2％琼脂糖电泳检查,结果所有沙门氏菌都扩增出了300bp的特异性产物,非沙门氏菌都未扩增出此目的条带。产物的特异性由slot blot杂交进一步证实。通过电泳判定结果,该法可检出扩增体系中10pg染色体DNA及10~2cfu的纽波特沙门氏菌50029。为下步克隆而设计的两个酶切点（Bam HI,Eco RI）对引物的特异性没有影响。本研究为沙门氏菌的检测提供了简洁、敏感、特异的新方法,同时为克隆invA基因做属特异性探针打下了基础。 相似文献
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PRRSV核衣壳蛋白基因在杆状病毒中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表的猪生殖 -呼吸道综合征病毒 ( PRRSV) CH-1 a分离株核衣壳 ( N)蛋白基因核苷酸序列和杆状病毒转移载体 p Blue-Bac-His B多角体蛋白阅读框架 ,设计合成了 1对特异性引物 P7S1 /P7R1。应用PCR对重组质粒 p UC1 8-ORF7扩增 ,获得了 CH-1 a株 N基因的片段。经 Hind 和 Bgl 双酶切 ,将其定向克隆到同样双酶切的 p Blue-Bac-His B的 PH启动子下游 ,获得转移载体 p Blue-Bac-His B-ORF7。将转移载体p Blue-Bac His B-ORF7与苜蓿银蚊夜蛾多核型多角体病毒 ( Ac MNPV,简称杆状病毒 )线性化 DNA ( Bac-N-Blue TMDNA)共转染 Sf9细胞 ,经过蓝斑筛选和蚀斑纯化 ,获得重组病毒 r Bac7。经用引物 P7S1 /P7R1和杆状病毒多角体蛋白基因通用引物 PCR鉴定 ,证明目的基因已插入到杆状病毒中。将重组病毒接种于对数生长期的 Sf9细胞 ,分别于感染后 2 4、4 8、72、96、1 2 0 h收集感染细胞 ,经 SDS-PAGE和 Western blot分析 ,结果表明 ,细胞接种重组病毒 2 4 h即开始表达重组蛋白 ,至 96h达到峰值 ,占整个细胞蛋白的 8.4 % ,此后开始下降。表达产物为融合蛋白 ,大小约 2 0 0 0 0。将重组病毒感染的 Sf9细胞用抗 PRRSV N蛋白的单克隆抗体SDOW-1 7进行间接免疫荧光试验 ,结果在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿 相似文献
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根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。 相似文献
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为研究PRRSV N蛋白的结构、功能以及N蛋白在病毒致病中的作用,以临床分离PRRSV毒株E11105为研究对象,采用Primer Premier 5.0设计一对特异性引物,经RT-PCR扩增出N基因片段,利用相关分子生物学软件对N基因序列进行分析;将N基因克隆连接到pColdⅠ原核表达载体上,经PCR、双酶切鉴定及序列测定后,得到重组质粒pColdⅠ-N,将pColdⅠ-N转入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达后用SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot验证分析。结果显示,分离株E11105N基因与北美洲型代表株VR-2332、欧洲型代表株Lelystad virus(LV)、中国2006年暴发的高致病性PRRSV代表株JXA1、中国代表株CH-1a的核苷酸序列同源性分别为93.3%、34.7%、99.2%、95.4%,氨基酸序列同源性分别为94.4%、15.3%、94.4%、99.2%;系统进化树显示,E11105株N基因与美洲型代表株VR-2332、中国高致病性JXA1毒株的亲缘关系较近;分离株E11105N基因所编码蛋白不存在跨膜区;二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,分别占20.33%和63.41%;预测该蛋白可能存在5个较为明显的B细胞优势抗原表位。SDS-PAGE蛋白电泳结果表明,重组N蛋白主要存在于菌体沉淀中,分子质量约为16.7ku;Western blot结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单克隆抗体识别,显色后条带约为16.7ku,与SDS-PAGE蛋白电泳的条带大小一致。 相似文献
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从PRRSV-ZB病毒株感染细胞培养物提取总RNA样本,以Oligo(dT)反转录后,针对PRRSVN、M和GP5基因进行PCR扩增。结果表明:N基因扩增效果明显高于GP5和M基因(p<0.05),N、M、GP5基因的最小检测量分别为0.1ug,0.1ug和0.4ug。对N、M和GP5基因的稳定性或保守性进行分析可见,M和N基因相对保守,GP5基因相对变异较大。本实验以N基因作目的基因,对11个临床发病猪场进行PRRS病原核酸检测,均扩增出377bp特异性条带。 相似文献