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1.
为了建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体检测的间接ELISA方法,本研究以纯化的原核表达的PEDV截短N蛋白作为包被抗原,建立了PEDV抗体检测的间接ELISA方法,将该方法命名为rnPED-ELISA。该抗原不与其他常见的7种猪病的阳性血清发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%;rnPED-ELISA相对于血清中和试验(SN)试验的敏感性为93.33%,特异性为90.00%;rnPED-ELISA与TSZ全病毒抗体检测试剂盒的符合率达91.67%。采用rnPED-ELISA方法检测200份临床样品,PEDV抗体阳性检出率为69.5%。本试验建立的rnPED-ELISA方法具有良好的敏感性和特异性,可为免疫猪群抗体监测和猪流行性腹泻流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。 相似文献
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《养猪》2020,(3)
为建立检测母猪乳汁中猪流行性腹泻病毒(PEDV)IgA抗体的间接ELISA方法,研究以PEDV重组N蛋白和纯化全病毒作为包被抗原,方阵滴定法优化反应条件,建立了两种检测猪乳汁中PEDV IgA抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组N蛋白和纯化全病毒的最佳包被抗原浓度均为2μg/mL,检测样品最佳检测稀释度分别为1∶10和1∶30,重复性试验的变异系数均小于10%,PEDV阳性乳汁的最低检测稀释倍数分别为1∶320和1∶960,对猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等阳性乳汁均无交叉反应性,两种方法对临床样品检测符合率为97.48%。表明两种方法均具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于检测和评价乳汁中特异性PEDV IgA抗体的水平。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2017,(6)
猪丁型冠状病毒(PDCoV)是2014年检测出的一种新型猪源肠道冠状病毒,对养殖业造成严重的经济损失。为建立快速检测PDCoV的血清学方法,本研究以原核表达的PDCoVN重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PDCoV重组N蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,原核表达的PDCoV重组N蛋白约为28ku,westernblot证实表达蛋白具有良好的反应原性;以其作为包被抗原建立的PDCoV抗体间接ELISA方法仅对PDCoV血清检测为阳性,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒等7种主要猪源病毒阳性血清均无特异性反应,具有良好的特异性。该方法检测灵敏度较高、重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于10%;采用该ELISA方法对我国2014年~2016年间采集的不同地区猪场的100份临床血清样品进行了检测,阳性率高于45.9%,表明我国猪群中存在PDCoV感染。本实验建立的ELISA方法可以用于检测临床样品中的PDCoV抗体,是PDCoV流行病学调查的一种有效工具,对该病的防控具有重要意义。 相似文献
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猪乳汁中抗猪传染性胃肠炎病毒IgA抗体间接ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立检测猪乳汁中抗猪染性胃肠炎病毒(TGEV)Ig A抗体的间接ELISA方法,本研究以TGEV重组N蛋白为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记羊抗猪Ig A为检测抗体,并采用方阵法确定包被抗原和待检乳汁的最佳工作浓度,对各种反应条件进行优化,建立了猪乳汁中TGEV Ig A抗体的间接ELISA检测方法。该方法检测稀释160倍的阳性乳清仍呈阳性;与猪流行腹泻和猪轮状病毒感染阳性乳清无交叉反应;批内和批间变异系数均小于10%。利用建立的ELISA方法与间接免疫荧光方法分别对134份临床样品进行检测,阳性检出率分别为58.2%(78/134)和59.7%(80/134),总符合率为85.6%。本研究建立的检测方法能够有效评估乳汁中TGEV Ig A抗体的水平。 相似文献
6.
《中国预防兽医学报》2016,(10)
为建立检测血清中猪δ冠状病毒(PDCoV)抗体的间接ELISA方法,本研究根据PDCoV的N基因序列设计特异性引物,扩增出N蛋白全基因序列,将其克隆至低温表达载体p Cold I中并转入BL21,诱导表达获得大小约为41 ku的可溶性目的蛋白;western blot试验表明所表达的蛋白具有反应活性。以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立了PDCoV间接ELISA抗体检测方法。结果表明,本研究建立的ELISA方法阴阳性临界值为0.316,与猪流行性腹泻病毒等6种猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性和稳定性均较好。应用建立的间接ELISA方法,对收集自江西各地区282份猪血清进行检测,阳性率为12.8%(36/282),表明PDCoV在我省猪群中普遍存在。本实验建立的PDCoV抗体捕获间接ELISA为临床上猪群PDCoV感染监测和流行病学调查提供了实验依据。 相似文献
7.
【目的】 建立快速、准确检测猪链球菌自溶素（atl）抗体的间接ELISA方法。【方法】 根据GenBank登录的猪链球菌atl基因序列设计1对引物,采用PCR方法从猪源链球菌中获得atl基因序列;构建pET-32a-atl和pGEX-4T-1-atl重组质粒,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达;以表达纯化后的atl-His融合蛋白为免疫原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;以兔多克隆抗体为一抗,用Western blotting方法检测atl-GST融合蛋白的反应原性;以纯化后的atl-GST融合蛋白为包被抗原,猪链球菌感染阳性血清作为标准血清,建立猪链球菌自溶素抗体的间接ELISA检测方法。利用本试验建立的ELISA方法与商用猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒同时对184份血清样品进行检测并用本试验建立的方法进行临床样品检测。【结果】 从猪链球菌中成功扩增出atl基因;构建的重组质粒,经诱导表达和纯化,获得大小为40 ku的atl-His和48 ku的atl-GST融合蛋白;经Western blotting验证,兔抗atl-His抗血清与atl-GST融合蛋白具有良好的反应原性;间接ELISA结果显示,该检测方法的阴阳临界值为0.318,阳性血清稀释至1：1 280检测仍为阳性;批内批间变异系数均<10%,表明该方法具有良好的重复性及敏感性。本试验所建立的ELISA方法检测出96份阳性样品,商用猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒检测出66份阳性样品,符合率为71.7%。应用建立的方法检测458份不同饲养阶段的猪血清样品,其中检出277份阳性样品,阳性率为60.4%。【结论】 本试验成功建立了检测猪链球菌自溶素抗体的间接ELISA方法并进行了初步应用,为猪链球菌病血清流行病学调查奠定了基础。 相似文献
8.
《中国兽医学报》2016,(11):1813-1817
为建立检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)血清抗体的间接ELISA方法,构建了高效表达PHEV核衣壳蛋白(N)的重组质粒(pET28a-N),Western blot检测该重组蛋白具有较好的免疫原性。以纯化的N重组蛋白作为包被抗原,通过方阵试验确定了抗原的最适包被浓度为2mg/L,酶标二抗的最佳稀释倍数为1∶10 000,建立了用于PHEV抗体检测间接ELISA方法。此外,用该法(N-ELISA)对天津市地区采集到的200份猪血清样品进行检测,阳性检出率为83.5%,与前期工作中建立的全病毒作为包被抗原的间接ELISA诊断方法 (HEV-ELISA)检测结果的符合率为90.91%。结果表明:以重组N蛋白为包被抗原所建立的用于PHEV血清抗体检测的方法能够用于检测PHEV感染及相关的流行病学调查。 相似文献
9.
《黑龙江畜牧兽医》2016,(18)
为建立一种敏感、特异、高通量的猪细小病毒抗体检测方法,参照猪细小病毒(PPV)VP2蛋白的基因序列设计合成1对特异性引物,PCR扩增了VP2蛋白主要抗原区域,将目的片段克隆至p ET30a原核表达载体中,获得了以可溶形式表达的重组VP2蛋白,重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测显示具有良好的抗原性;以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明:用该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制试验(HI)方法的符合率为94.49%;应用该方法检测869份疫苗免疫猪血清样品,免疫合格率为87.92%;检测248份未免疫疫苗猪血清样品,阳性感染率为7.25%。 相似文献
10.
《中国预防兽医学报》2019,(9)
为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清特异性IgA抗体的间接ELISA方法,本研究利用融合PCR的方法,将PEDV G2型LNct2a株S蛋白的S1基因片段与人源IgG分子的Fc基因片段融合,克隆于真核表达质粒pAAV-IRES-hr GFP中,构建真核表达质粒pAAV-LNCT2-S1-Fc并转染293T细胞,表达并纯化了S1蛋白。以纯化的S1蛋白作为包被抗原,以羊抗猪IgA-HRP为二抗,通过优化反应条件,建立了检测PEDV G2型特异性IgA抗体的间接ELISA方法,并对该方法进行了特异性、敏感性及重复性试验。特异性试验结果显示该方法对猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒和圆环病毒的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验结果显示该方法能够检测出400倍稀释的阳性血清;批内和批间重复性变异系数均小于10%。利用该间接ELISA方法和间接免疫荧光方法(IFA)同时对临床样品检测,结果显示二者总符合率为98.6%。本研究建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,能够用于检测及评价血清中PEDV特异性IgA抗体的水平,为PEDV流行情况及免疫效果评价提供了有效的手段。 相似文献
11.
为建立快速检测猪萨佩罗病毒(PSV)的血清学方法,本研究以原核表达的PSV 3C重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PSV重组3C蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该ELISA方法仅对PSV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无特异性反应,具有良好的特异性。该方法的批内和批间重复性变异系数均小于10%,血清稀释度可以达到1∶320;采用该ELISA方法对我国2016年间采集的江苏省6个不同地区猪场的281份临床血清样品进行了检测,阳性率高达38.43%,表明江苏地区猪群中存在PSV感染。本实验建立的ELISA方法可以用于检测临床样品中的PSV抗体,特异性强、敏感性高、重复性好,是PSV流行病学调查的一种有效工具,对该病的防控具有重要意义。 相似文献
12.
为深入了解仔猪腹泻的病因,本研究在不同发病猪场采集了115份临床样品,通过RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)进行检测,结果显示总阳性率为81.7%。进一步从部分样品中对PEDV的N基因进行克隆和序列分析,结果显示采集的临床样品中各分离株之间的氨基酸同源性高达99%以上,与代表性病毒株CV777的氨基酸同源性为97.4%～98.1%,表明目前流行的PEDV其N基因仍然相对保守的。同时,构建了重组表达载体pGEX-N,经诱导表达显示该重组蛋白呈可溶性表达,重组蛋白大小约为81 ku,western blot分析结果表明该重组蛋白能够被PEDV阳性猪血清特异性识别。将纯化后的重组N蛋白作为包被抗原,对20份已知背景的临床猪血清抗体进行ELISA检测,结果显示有9份血清为抗体阳性,11份血清呈抗体阴性,与应用RT-PCR方法鉴定抗原的结果符合率为85%。本研究表达的重组N蛋白具有良好的抗原性,可以将其作为PEDV血清学诊断的候选抗原。 相似文献
13.
《畜牧与兽医》2020,(8)
试验旨在建立一种快速的猪圆环病毒3型(PCV3)抗体检测方法。采用PCR方法对PCV3 ORF2基因主要抗原区域进行扩增,并利用原核表达系统进行截短表达,以纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法。结果显示:PCR扩增了片段大小为348 bp的ORF2基因主要抗原区域,PCR扩增产物克隆至pET-32a原核表达载体,转入大肠杆菌BL21,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,纯化后经Western blot鉴定表明具有良好的反应活性。以重组蛋白作为包被抗原建立了检测PCV3抗体的间接ELISA方法,对PCV3阳性血清的最低检出效价可达1∶20 480;用该方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪常见疫病阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于5%。应用该方法检测四川地区533份不同日龄临床猪血清样品,PCV3阳性感染率达14.82%。表明建立的ELISA方法具有良好的敏感性、特异性、重复性和临床适用性,为我国商品化PCV3血清学抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。 相似文献
14.
《中国兽医学报》2014,(10):1568-1572
以纯化的重组猪流行腹泻病毒(PEDV)中国变异株S蛋白为包被抗原,建立了检测PEDV流行株抗体的间接ELISA方法。所建方法最佳反应条件为:抗原最适包被量为1μg/孔,包被时间为37℃1h后4℃过夜;血清工作浓度为1∶100,作用时间为1.5h;二抗选用HRP标记的兔抗猪IgG稀释度为1∶4 000,作用时间为1.5h;显色液TMB作用时间为15min;判定标准为,样品S/P值大于等于0.058判定为阳性,小于0.045判定为阴性。所建ELISA方法具有良好的特异性和重复性。对50份疑似猪流行性腹泻血清样品进行检测,该方法与PEDV病原检测结果有较高的符合率。结果表明本研究所建立ELISA方法可用于PEDV流行株抗体检测和疫病监测。 相似文献
15.
为了建立检测猪细小病毒(PPV)野毒抗体的间接ELISA检测方法,并掌握南充市猪细小病毒的感染情况,试验以原核表达的NS1蛋白为包被抗原建立检测PPV野毒抗体的间接ELISA方法,并应用该方法对2017年采集于南充市9个区(县)的1 854份猪血清样品进行检测与分析。结果表明:建立的NS1蛋白间接ELISA方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清和PPV疫苗免疫血清均为阴性,与HI试验的符合率达98.44%。在1 854份血清样品中共检测出PPV阳性样品349份,总阳性感染率达18.82%。其中南充市9个区县均存在PPV的感染,感染率为5.45%～36.79%;规模猪场、散养户和屠宰场的感染率分别为15.04%、26.39%和17.30%;种公猪、种母猪、后备母猪、仔猪和育肥猪的感染率分别为5.88%、24.75%、23.91%、17.38%和19.13%;自繁自养、自繁+引种、自繁+购活体、购活体4种不同繁育方式的感染率分别为13.58%、21.50%、19.77%和21.12%。说明试验成功建立了检测猪细小病毒野毒抗体的间接ELISA检测方法,且南充市养猪场普遍存在猪细小病毒的感染。 相似文献
16.
本研究旨在建立一种可靠的检测猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）IgG抗体的间接ELISA方法,了解四川地区PDCoV的流行情况。采用原核表达系统表达PDCoV膜蛋白（M）作为检测抗原,通过反应条件的优化,建立了基于PDCoV M蛋白的间接ELISA方法,命名为PDCoV-rM-ELISA,并用该方法对430份临床样品进行检测。成功构建了重组表达菌BL21-pET-32a-M,经诱导表达后获得了重组M蛋白,Western bolt检测表明,重组蛋白具有良好的反应原性。以其作为包被抗原建立的PDCoV-rM-ELISA方法仅对PDCoV血清检测为阳性,与猪流行性腹泻病毒等5种猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法灵敏性高、重复性好,批间和批内重复性变异系数均小于10%;与成品化PDCoV抗体检测试剂盒同时检测48份临床血清,两种方法的阳性符合率为88.46%,阴性符合率为90.91%,总符合率为89.58%。临床样品检测结果表明,各地样本PDCoV抗体阳性率平均为11.86%,且统计学分析显示,母猪比仔猪和育肥猪高2.25倍的PDCoV感染概率。笔者成功表达了PDCoV M蛋白,建立了PDCoV-rM-ELISA检测方法,该方法具有较高的敏感性、良好的特异性和重复性,可用于临床猪血清样品种PDCoV IgG抗体的检测。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2019,(8)
为建立A型塞尼卡病毒(SVA)血清学检测方法,本研究根据GenBank中SVA基因序列设计引物,PCR扩增其VP1基因,将目的片段克隆于p ET-32a(+)表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3+)中诱导表达。利用纯化的重组VP1 (rVP1)蛋白作为包被抗原,通过矩阵法优化ELISA反应条件,初步建立了SVA的间接ELISA抗体检测方法。对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检测;利用该方法对43份背景清晰的猪血清进行检测,并与中和试验结果进行比较;同时对205份临床猪血清样品进行检测。结果显示,本研究正确表达了约51.0 ku的可溶性重组蛋白,western blot试验表明纯化的r VP1蛋白具有良好的反应原性,以r VP1蛋白建立了间接ELISA方法。特异性试验结果显示该ELISA方法可以检测SVA抗体,而与FMDV (O/A/Asia I)、 PEDV、 PCV2、PRRSV、PRV等病原的抗血清均无交叉反应;敏感性试验结果显示样品经1∶800倍稀释后折OD450nm值仍大于临界值;批内、批间的重复性试验变异系数均小于10%,具有较好的重复性和稳定性。43份猪血清样品的检测结果与中和试验符合率为93.02%。205份临床猪血清样品的阳性检出率为5.37%。本研究为SVA血清学检测提供了技术手段。 相似文献
18.
PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表达及ELISA方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白抗体的ELISA方法,应用RT-PCR从腹泻仔猪样本中扩增获得了1段PEDV河南流行毒株N基因全长序列,根据对其氨基酸序列的抗原性分析结果,将N基因上2个大的抗原表位区(112321位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32α,构建pET-32α-N重组质粒并转化至宿主菌BL21(DE3)中。将重组菌在37℃条件下加入IPTG进行诱导使该蛋白获得了高效表达,表达产物为融合蛋白,相对分子质量约41 300。Western-blot分析表明,所表达的蛋白可与抗PEDV全病毒小鼠阳性血清发生反应。以纯化的重组N蛋白作为包被抗原建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法,抗原最佳包被量0.226μg/孔,血清最佳稀释度为1∶100,二抗最佳稀释度为1∶2 000,待检血清D450值≥0.28判定为阳性。国内首次用该方法对临床猪血清样本进行了检测,母猪血清PEDV抗体阳性率为84.26%(166/197),仔猪血清阳性率为27.93%(31/111)。结果表明,建立的间接ELISA方法特异性、灵敏性和可重复性良好,可用于临床上PEDV抗体水平的监测和PED流行病学调查。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2020,(7)
本研究旨在建立一种可靠的检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV) IgG抗体的间接ELISA方法,了解四川地区PDCoV的流行情况。采用原核表达系统表达PDCoV膜蛋白(M)作为检测抗原,通过反应条件的优化,建立了基于PDCoV M蛋白的间接ELISA方法,命名为PDCoV-rM-ELISA,并用该方法对430份临床样品进行检测。成功构建了重组表达菌BL21-pET-32a-M,经诱导表达后获得了重组M蛋白,Western bolt检测表明,重组蛋白具有良好的反应原性。以其作为包被抗原建立的PDCoV-rM-ELISA方法仅对PDCoV血清检测为阳性,与猪流行性腹泻病毒等5种猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法灵敏性高、重复性好,批间和批内重复性变异系数均小于10%;与成品化PDCoV抗体检测试剂盒同时检测48份临床血清,两种方法的阳性符合率为88.46%,阴性符合率为90.91%,总符合率为89.58%。临床样品检测结果表明,各地样本PDCoV抗体阳性率平均为11.86%,且统计学分析显示,母猪比仔猪和育肥猪高2.25倍的PDCoV感染概率。笔者成功表达了PDCoV M蛋白,建立了PDCoV-rM-ELISA检测方法,该方法具有较高的敏感性、良好的特异性和重复性,可用于临床猪血清样品种PDCoV IgG抗体的检测。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2017,(6)
为了建立检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体的间接ELISA方法,初步分析PED灭活疫苗免疫母猪所产仔猪的血清母源特异抗体动态,笔者应用重组PEDV部分纤突(spike,S)蛋白作为检测抗原,建立了基于PEDV S1蛋白的间接ELISA抗体检测方法,并用该方法检测了产前4周用PED灭活疫苗免疫母猪的初乳、分娩当天血清及其仔猪1、7、14、21、28和35日龄(d)时血清中的PEDV抗体。结果显示:建立的间接ELISA方法能够特异地检测PEDV抗体,与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒及猪轮状病毒的抗血清无交叉反应;敏感性高于免疫过氧化物酶单层试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA),与IPMA检测结果的符合率为97.14%;批内和批间重复性试验的变异系数小于10%。免疫母猪初乳、分娩当天血清中的PEDV抗体阳性率为100%,初乳比血清中的平均抗体水平低;1d仔猪血清PEDV抗体阳性率为50%,平均抗体水平低,与初乳中的抗体水平接近,7d以后所有仔猪血清全部转为PEDV抗体阴性。建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法;产前用PEDV灭活疫苗给怀孕母猪免疫1次时,其所产仔猪血清中的母源特异抗体阳性率和抗体水平低,且维持时间短暂。 相似文献