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将猪IL2基因和PPV VP2基因、PCV2 ORF2截短基因克隆至真核表达载体pCI-neo,构建了重组质粒pCI-ORF2-VP2和pCI-IL2,用脂质体介导法将pCI-ORF2-VP2质粒转染PK15细胞,采用间接免疫荧光法检测在体外的表达情况。并以小鼠为动物模型,将pCI-IL2和pCI-ORF2-VP2质粒联合肌注免疫小鼠,相同剂量免疫2次,间隔2周,同时设立pCI-ORF2-VP2、pCI空载体、猪细小灭活苗、圆环亚单位苗对照,检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞的转化功能,外周血T淋巴细胞亚群的动态变化及血清抗体的滴度。结果显示,pCI-ORF2-VP2在PK15细胞中能正常表达,联合免疫组在第28天能够检测到PPV和PCV2抗体,第21~42天诱导淋巴细胞转化和CD4+、CD8+细胞的数量高于或显著高于pCI-ORF2-VP2质粒组。结果表明,猪IL2质粒联合肌注可以提高VP2/ORF2核酸疫苗的免疫效果。 相似文献
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将猪细小病毒(PPV)VP2基因和猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2截短基因(47～207aa)克隆到真核表达载体pCI-neo,构建了含VP2和ORF2基因的融合表达质粒pCI-ORF2-VP2,经脂质体法转染PK15细胞后,用间接免疫荧光检测法测到融合蛋白能正常表达。将pCI-ORF2-VP2质粒肌注BALB/c小鼠(100μg/只),相同剂量免疫2次,间隔2周,同时设立圆环亚单位苗、细小灭活苗和空载体对照组,于免疫后7、14、21、28、42d无菌摘取脾脏作T淋巴细胞增殖试验,摘眼球采凝血和抗凝血,分别作PPV、PCV2抗体的监测和T淋巴细胞亚群的动态监测。结果显示,pCI-ORF2-VP2免疫小鼠脾脏T淋巴细胞对ConA刺激的反应性、诱导CD4+、CD8+T淋巴细胞的免疫功能和血清PPV/PCV2的抗体水平在不同时间段均显著高于空载体对照组。表明真核表达质粒pCI-ORF2-VP2能刺激小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫。 相似文献
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将干扰素-γ、猪圆环病毒Ⅱ型ORF2主要抗原表位(47-85位AA)和猪细小病毒VP2基因克隆至pCI-neo真核载体中,构建重组质粒pCI-IFN-γ.ORF2.VP2.用脂质体介导法将其转染到MDBK细胞中,利用RT-PCR和间接免疫荧光法检测产物的表达情况.将重组质粒pCI-IFN-γ.ORF2.VP2、pCI-ORF2.VP2、对照质粒pCI-neo、PBS、猪细小病毒火活苗和猪圆环病毒亚单位疫苗通过肌肉注射免疫小鼠,检测小鼠不同时期的淋巴细胞转化功能、T淋巴细胞亚群动态变化情况以及PPV、PCV2抗体水平.试验结果显示,在转染重组质粒的MDBK细胞中能扩增到ORF2-VP2和IFN-γ基因;转染后48 h用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达.pCI-IFN-γ.ORF2.VP2免疫组从第7天开始脾淋巴细胞对ConA有明显反应,显著高于对照组和PCI-ORF2.VP2免疫组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组和pCI-ORF2.VP2免疫组;在免疫后第14天检测到PPV PCV抗体.结果表明,pCI-IFN-γ.ORF2.VP2能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫. 相似文献
4.
为研制猪细小病毒(PPV)主要保护性抗原VP2基因核酸疫苗,本研究将猪圆环病毒(PCV)编码T细胞表位P21多肽的序列连接于PPV VP2基因的5’端克隆于pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA-P21-VP2,并将其经磷酸钙介导转染HEK293T细胞中检测其表达情况。SDS-PAGE和western blot检测表明,P21-VP2重组蛋白获得了有效的表达,其分子量约为67 ku。将pcDNA-P21-VP2肌肉注射BALB/c小鼠后,采用ELISA方法检测其抗体,并采用MTT法检测小鼠免疫后脾脏淋巴细胞的增殖活性。试验结果表明,重组质粒能够有效诱导小鼠产生明显的抗体反应,并且对淋巴细胞的增殖反应有明显促进作用。该实验结果为研制有效的PPV核酸疫苗奠定了基础。 相似文献
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为了研究PCV2ORF2的不同抗原表位重组PPV VP2基因真核表达质粒的体外表达情况与免疫原性,分别以PCV2SC株和PPV SC-1株为模板,扩增PCV2ORF2的抗原表位基因A、B、C(A:117～131aa,B:157～183aa,C:165～200aa)和PPV VP2基因。将A、B、C基因分别与PPV VP2基因串联,并插入到pCI真核表达载体中,构建了能同时表达PPV VP2蛋白和PCV2ORF2抗原表位的重组质粒pCI-A-VP2、pCI-B-VP2、pCI-C-VP2。将重组真核表达质粒转染MDBK细胞,用间接免疫荧光试验检测各个质粒在细胞中的表达情况;并将其免疫小鼠,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法检测免疫效果。结果显示,3种重组表达质粒转染细胞48h后都能检测到较强的免疫荧光;免疫小鼠后14～42d诱导的T淋巴细胞转化效率、CD4+/CD8+细胞比值以及PPV和PCV2抗体均显著高于对照组,且pCI-B-VP2免疫效率高于其他组。该结果表明PCV2ORF2上157～183aa抗原表位在3个抗原表位中抗原性最强,可作为PCV2与其他病毒二联疫苗研究的主要抗原表位。 相似文献
6.
为了研究PCV2ORF2的不同抗原表位重组PPVVP2基因真核表达质粒的体外表达情况与免疫原性,分别以PCV2SC株和PPVSC-1株为模板,扩增PCV2ORF2的抗原表位基因A、B、c（A：117～131aa,B：157～183aa,C：165～200aa）和PPVVP2基因。将A、B、C基因分别与PPVVP2基因串联,并插入到pCI真核表达载体中,构建了能同时表达PPVVP2蛋白和PCV20RF2抗原表位的重组质粒pCI—A—VP2、pCI13-Vp2、pCI—C—VP2。将重组真核表达质粒转染MDBK细胞,用间接免疫荧光试验检测各个质粒在细胞中的表达情况;并将其免疫小鼠,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法检测免疫效果。结果显示,3种重组表达质粒转染细胞48h后都能检测到较强的免疫荧光;免疫小鼠后14～42d诱导的T淋巴细胞转化效率、CD4＋／CD8＋细胞比值以及PPV和PCV2抗体均显著高于对照组,且pCI—13-VP2免疫效率高于其他组。该结果表明PCV2ORF2上157～183aa抗原表位在3个抗原表位中抗原性最强,可作为PCV2与其他病毒二联疫苗研究的主要抗原表位。 相似文献
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《中国兽医学报》2015,(9):1422-1428
为了获得表达猪细小病毒(PPV)VP2蛋白和细胞因子猪白细胞介素-18(IL-18)的重组猪伪狂犬病毒(PRV)。将PPV VP2基因和猪IL-18基因分别插入到PRV转移质粒PG中,得到重组质粒PG18-VP2。利用脂质体转染法将重组转移质粒PG18-VP2与猪PRV弱毒株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,以EGFP荧光标记,通过5轮蚀斑筛选纯化,成功获得表达PPV VP2蛋白和猪IL-18且带EGFP标记的重组伪狂犬病毒IL18-VP2-rPRV。用重组病毒感染ST细胞,12h后在荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光;通过RT-PCR证实感染细胞中含有PPV VP2和猪IL-18mRNA;Western-blot试验结果显示,重组病毒能表达具有生物活性的PPV VP2蛋白和猪IL-18。重组病毒经连续20次传代后感染细胞仍能发出绿色荧光,PCR检测表明VP2及IL-18基因在重组病毒中能稳定遗传。为进一步研究表达PPV VP2蛋白和猪IL-18的重组猪伪狂犬病毒的免疫效力奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医杂志》2015,(9)
通过采集疑似猪圆环病毒感染的病料,分离到1株猪圆环病毒2型贵州株,并对其进行了鉴定。原核表达试验结果表明,PCV-2贵州株的ORF2基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达的目的蛋白约为40.0 k Da,且复性蛋白具有一定免疫原性。将真核表达质粒分别转染PK-15细胞,以掌握ORF2基因和白细胞介素-2(IL-2)基因体外表达情况;将重组质粒、空载体及生理盐水分别免疫BALB/c小鼠,以监测血清中特异性抗体及T淋巴细胞亚群含量,从而探讨猪圆环病毒Ⅱ型贵州分离株ORF2基因真核表达效果及长白猪细胞因子IL-2对PCV2 ORF2免疫原性的影响,结果表明,pc DNA3.1-ORF2和pc DNA3.1-ORF2-IL-2在PK-15细胞中获得了较高的表达,IL-2可明显增强PCV-2 DNA免疫效果。 相似文献
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联合表达PCV2 ORF2和PPV VP2基因病毒样颗粒获得及免疫原性 总被引：1，自引：0，他引：1
将包含有完整阅读框架,长1 740、705 bp的PPV VP2基因、PCV2 ORF2基因分别插入真核表达栽体pPI-2.EGFP,构建了重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2.观察由脂质体介导转染重组质粒后的Vero细胞,结果最早在转染后20 h左右出现荧光,36 h达到高峰;对转染细胞进行电镜检测,结果观察到病毒样颗粒存在.为证实所获病毒样颗粒是否为重组颗粒,将纯化后的病毒样颗粒免疫仔猪,检测其血中T淋巴细胞的动态变化以及血清抗体水平.结果免疫仔猪的CD3+、CD4+T淋巴细胞在外周血淋巴细胞中的比率均有一定程度的升高;CD8+T淋巴细胞在免疫后7～14 d有所下降,之后再升高.抗体检测结果表明,免疫动物血清中有较高水平的PPV、PCV2特异性抗体.结果表明重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2获得成功表达并形成重组病毒样颗粒,且该颗粒具有良好的免疫原性. 相似文献
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【目的】原核截短表达猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6,PPV6)ORF2基因,并制备PPV6 VP1((348 aa-675 aa))蛋白多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】以PPV6分离毒株基因组为模板,PCR扩增获得ORF2截短基因片段,将其克隆至原核表达载体pET30a(+)中构建重组质粒pET30a-PPV6-ORF2。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化后重组蛋白。将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,采用Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和间接ELISA鉴定免疫兔血清特异性。【结果】成功构建了pET30a-PPV6-ORF2重组表达载体,原核截短表达了PPV6 VP1((348 aa-675 aa))蛋白;SDS-PAGE结果显示,重组PPV6 VP1( 相似文献
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Vrieling H 《Tijdschrift voor diergeneeskunde》2007,132(1):979-980
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以紫花苜蓿金皇后为材料,采用温室盆栽的方法对其在不同浓度Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+下的生长及结瘤情况进行探讨,结果表明:不同浓度不同离子对紫花苜蓿地上生物量及结瘤情况影响各有不同,其中Ca2+浓度为90mg/L时植株结瘤数目最丰,促进植株结瘤的作用最为明显;Mg2+浓度80mg/L时植株根冠比最大,为41.56％;Fe2+对植株结瘤数与蛋白质含量的影响作用最不明显,浓度为15mg/L时植株地上生物量干重为0.41g/株,增产作用优于Ca2+和Mg2+;Zn2+浓度为2.0mg/L时地上生物量干重(0.56g/株)和粗蛋白质含量(18.78％)均最高,对植株产量增加与蛋白质含量累积作用最为显著. 相似文献
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病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是某种病毒的1种或几种结构蛋白在体外组装而成,由于VLPs不包含病毒基因组,在宿主细胞中不能自我复制,因此VLPs在亚单位疫苗应用中具有较高的生物安全性。自猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)在世界范围内流行以来,已经给全球养猪业带来巨大经济损失,因此PCV2的致病机理和疫苗研究具有重要现实意义。PCV2Cap蛋白(capsid protein)是病毒唯一的衣壳蛋白,也是主要的免疫原性蛋白,60个Cap蛋白亚基在体外能自行组装成PCV2VLPs,该VLPs因与天然病毒粒子形态相似并保留了病毒完整的构象表位,已经在PCV2组装和侵染机理研究、亚单位疫苗的研发及其相关性系统疾病(PCV2-systemic disease,PCV2-SD)的预防研究中得到广泛应用。本文主要对PCV2Cap蛋白的Loops结构及其VLPs的制备研究进展进行阐述,为PCV2侵染机理与亚单位疫苗的研发等提供参考。 相似文献
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本研究采用RT-PCR方法自刀豆素（Con A）刺激的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增克隆了猪白细胞介素-2（porcine interleutin-2,PoIL-2）成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪白细胞介素-2（rPoIL-2）蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用MTT法测定rPoIL-2蛋白促小鼠细胞毒性淋巴样系CTLL-2株细胞增殖活性以评价rPoIL-2的活性。结果表明,成功克隆了rPoIL-2的成熟肽基因,基因全长405 bp,编码134个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子质量大小约为16.5 ku,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白质纯度在96%以上;纯化的rPoIL-2蛋白促小鼠CTLL-2株细胞增殖活性最高值是对照细胞的3倍。本研究成功表达了具有生物学活性的PoIL-2蛋白,为新型基因工程抗病毒制剂和免疫增强剂的开发奠定了基础。 相似文献