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为建立一种诊断牛结核病的间接ELISA方法,以牛分枝杆菌Rv3403c、CFP10和ESAT6蛋白为靶标抗原,通过酶切连接和重叠延伸PCR方法,将3个抗原基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接,构建出pET-28a-Rv3403c-CFP10-ESAT6并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化目的蛋白并分析其反应原性。以纯化后的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法。结果显示：通过SDS-PAGE和Western blot鉴定分析,成功表达并纯化出包涵体蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6,目的蛋白具有良好的反应原性;以融合蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,与其他牛病原体阳性血清不发生交叉反应。临床结果显示,本方法与商品化试剂盒阳性符合率为66.7%,阴性符合率99.3%,总符合率为99.3%。研究表明,成功串联表达了具有良好反应原性的融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6,并以此为包被抗原建立了一种牛分枝杆菌间接ELISA抗体检测方法,为检测和净化牛结核病提供了诊断工具。 相似文献
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结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达 总被引：3，自引：0，他引：3
以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和 CFP10的成功表达为结核病诊断及重组疫苗的构建打下了基础 相似文献
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猪A组轮状病毒VP4全基因在大肠杆菌中的表达与检测 总被引：1，自引：1，他引：0
以猪轮状病毒mRNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了2331bp的VP4全基因,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆质粒pGEM-T-VP4.以BamHⅠ和SalⅠ双酶切pGEM-T-VP4和pGEX-6P-1,并将纯化的VP4基因亚克隆至融合型表达载体pGEX-6P-1中,构建出原核表达质粒pGEX-6P-VP4.将pGEX-6P-VP4转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约111.47 ku融合蛋白带.Western blot分析发现,该蛋白具有轮状病毒抗原性,从而为进一步研究轮状病毒的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础. 相似文献
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南非Ⅱ型口蹄疫主要抗原表位串联基因的表达及抗原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
在对南非Ⅱ型口蹄疫病毒抗原分析基础上,将已经筛选出的6条抗原性良好的多肽采用柔性linker拼接,人工合成相应核苷酸后连入T载体中。将酶切回收的串联基因(VP1-VP3)克隆于表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-VP1-VP3。该质粒转化于感受态细胞BL21(DE3) plysS中,经IPTG诱导后进行了可溶性分析和Western blotting分析,且对融合蛋白柱上酶切纯化后进行了抗原性分析。重组质粒pGEX-VP1-VP3的PCR和测序结果表明,VP1-VP3串联基因已成功插入pGEX-6p-1载体中;pGEX-VP1-VP3融合蛋白分子质量约为38.3 ku,并以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,该融合蛋白与南非Ⅱ型FMDV阳性血清能发生特异性反应;酶切纯化后蛋白间接ELISA鉴定结果表明,表达的VP1-VP3蛋白具有良好的免疫原性与反应原性。串联多肽的成功表达,将为南非型口蹄疫血清学检测方法建立奠定基础。 相似文献
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以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组DNA为模板，经重叠PCR扩增获得CFP10-ESAT-6融合基因片段，克隆于pET21a表达载体中，获得了重组质粒pET21a—CFP10—ESAT—6，将其转化大肠杆菌BL21细胞，经IPTG诱导表达，得到了25ku的目的蛋白。表达产物经纯化和定量分析后免疫新西兰大白兔，收集兔血清进行抗体ELISA检测。结果显示，成功构建了CFP10-ESAT-6融合基因的原核表达质粒，获得了CFP10-ESAT-6融合蛋白，以此蛋白免疫动物可产生高效价的抗体。 相似文献
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本研究以鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1基因为研究对象,设计特异性引物扩增S1抗原集中区目的基因,长度为198 bp,亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-S1,转化至宿主菌Rosetta(DE3)后进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,表达获得1条特异性蛋白条带,其分子质量大小为33.0 ku,与预期蛋白大小一致。可溶性分析结果表明目的蛋白以包涵体形式存在。Western blotting结果显示,重组蛋白能与IBV鸡阳性高免血清反应,被GST标签单抗识别,结果表明该融合蛋白正确表达并具有良好的抗原性。本研究为制备IBV单克隆抗体奠定了抗原基础。 相似文献
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试验旨在构建牛分枝杆菌eis基因的穿梭表达载体,鉴定其在重组耻垢分枝杆菌中的生物学活性。采用PCR技术扩增并克隆牛分枝杆菌eis基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261-Mbeis,经双酶切和测序鉴定其正确性,利用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc2155中,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达,质谱鉴定目的蛋白氨基酸序列。研究结果表明,成功构建了牛分枝杆菌eis基因穿梭表达载体pMV261-Mbeis;生长曲线表明负载重组质粒不会影响耻垢分枝杆菌的体外生长;SDS-PAGE和Western blotting检测证实了牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中可表达出分子质量约44 ku的eis蛋白;质谱检测证明了该蛋白即为牛分枝杆菌eis蛋白。本研究构建的牛分枝杆菌eis基因穿梭表达质粒pMV261-Mbeis在耻垢分枝杆菌中具有生物学活性,为下一步研究表达产物eis蛋白的功能奠定了基础。 相似文献
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新城疫病毒F基因在大肠杆菌中的高效表达及其免疫原性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
应用PCR技术,以含有新城疫病毒F48E8株全长融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pVAX1-F为模板,扩增出594bp大小的F基因的部分片段.经克隆筛选和测序后,构建成重组原核表达质粒pGEX-6P-1-F.重组质粒转化表达菌BL21,获得重组菌BL21(pGEX-6P-1-F).经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,F基因在原核表达体系中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的23%.Western blotting结果显示,在相对分子质量46 ku位置有特异性条带.动物实验结果表明,F蛋白免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体效价显著高于空白对照组(P＜0.05),说明原核表达系统表达的F蛋白具有良好的免疫原性. 相似文献
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中国株兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性鉴定 总被引：11，自引：0，他引：11
应用RT—PCR技术扩增编码兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)WX84株衣壳蛋白VP60基因，将PCR产物按相应的阅读框架克隆到表达性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21株，在1．0mmol／L 1PTG和37C的条件下诱导，VP60—GST基因融合蛋白获了高效表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和western-blotting试验证实所表达的融合蛋白产物相对分子质量与预期的87000相符。将表达产物经电泳切胶回收目的条带后免疫小鼠，所得抗血清应用间接ELISA检测，与RHDV病毒粒子呈阳性反应。试验结果表明，大肠杆菌中表达的RHDVVP60融合蛋白在抗原性上与天然衣壳蛋白具有一定的相似性。 相似文献
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《中国兽医学报》2014,(9):1486-1490
CFP-10和ESAT-6是牛分枝杆菌的免疫优势抗原,可诱导机体产生IFN-γ,在牛结核病的免疫诊断中发挥重要作用。本试验分别克隆了牛分枝杆菌CFP-10和ESAT-6基因,并将这2个基因融合扩增,构建重组表达质粒pET28a/CFP-10-ESAT-6,重组质粒在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达。重组蛋白主要以分泌表达的形式存在于表达上清中,收集上清中的目的蛋白进行Ni亲和层析柱和分子筛两步纯化,蛋白纯度分别达到90%和95%。将纯化的重组蛋白以2mg/L的质量浓度包被酶标反应板,用间接ELISA方法检测不同来源牛血清中的结核病抗体,结果表明,表达的重组融合蛋白具有良好的抗原活性,可有效识别阴、阳性结核病血清。 相似文献
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传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5基因序列,设计合成了一对VP5基因特异性引物,应用RT-PCR技术从IBDV标准毒株中扩增得到VP5基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-1-VP5,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,IBDV VP5基因在大肠埃希菌BL21中得到了正确表达,所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。 相似文献
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构建牛瑟氏泰勒虫P23基因片段原核重组表达质粒,表达重组蛋白。采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因,将扩增产物与pMD18-T-Simple载体连接,测序,验证扩增产物。将P23基因片段克隆到载体pGEX-4T-3上,经酶切分析、PCR鉴定后,IPTG诱导表达,最后用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物。结果表明克隆的P23基因片段为684 bp,重组质粒pGEX-4T-3/P23构建成功;SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量约为58 ku;Western blotting分析结果显示,与牛瑟氏泰勒虫阳性血清发生反应,而与牛瑟氏泰勒虫阴性血清无反应,表明牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白具有良好的抗原性和特异性,提示可以利用融合蛋白来建立检测抗体的间接ELISA诊断方法。 相似文献
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本研究对破伤风毒素C片段进行了基因克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性分析。应用PCR技术直接从破伤风梭菌64008菌株基因组中扩增出大小为1356 bp的破伤风毒素C片段(TetC)基因,经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank上登录的序列AF154828的同源性达到99.2%。将此基因克隆至大肠杆菌融合表达载体pGEX-6P-1,构建成重组表达质粒pGEX-6P-1-TetC,并在大肠杆菌BL21中表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的21%。经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定,表达产物为76 Ku左右的重组蛋白,经免疫印迹试验证实该重组蛋白是破伤风毒素C片段抗原。 相似文献
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禽多杀性巴氏杆菌C48-1成熟外膜蛋白H基因原核表达最适条件的探索 总被引：1，自引：0，他引：1
应用PCR扩增出禽多杀性巴氏杆菌C州成熟外膜蛋白H基因(ompm H)，将ompm H片段按正确的阅读框定向插入原核表达载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游，获得了重组表达质粒pGEX-ompm H。然后将重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)，当转化菌的D600nm值达到0．6～0．8时，对异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)的诱导浓度、诱导时间和诱导温度等条件进行了试验，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳判定融合蛋白GST-ompm H表达的最适条件。结果，当细菌的D600nm值为0．6～0．8时，IPTG最佳诱导浓度为0．8mmol／L，最佳诱导时间为4h，最适诱导温度为25℃。并用免疫印迹法对表达产物进行检测。结果显示表达的融合蛋白GST-ompm H能与C48-1外膜蛋白免疫血清发生特异性反应，证明pGEX-6p-1载体表达的融合蛋白保留了天然蛋白的抗原性。 相似文献
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从已构建的PRRSV ORF7重组质粒pUCm-T-ORF7中用PCR扩增ORF7基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒pGEX-4T-3-ORF7并转化大肠杆菌.经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,成功表达了谷胱苷肽转移酶(GST)融合的核衣壳蛋白(N),重组N蛋白表达量约为菌体总蛋白的35%,主要以可溶的形式存在,且能形成同源二聚体.重组N蛋白经谷胱苷肽凝胶(glutathione sepharose 4B)亲和层析后得到高度纯化,并将该蛋白作为抗原建立了间接ELISA检测方法.利用该方法对某猪场76份猪血清进行检测并将结果与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果作比较,2种方法的总符合率达93.4%,检测结果之间差异不显著(P＞0.05).结果表明大肠杆菌表达的重组GST融合N蛋白具有良好的抗原性,因而有望利用该重组蛋白开发为试剂盒应用于临床PRRSV抗体的检测. 相似文献
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α-银环蛇毒素融合基因表达载体的构建及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
设计并人工合成2条引物,对作者构建的重组质粒pMD-α-BGT进行PCR扩增获得α-BGT基因。将目的基因连接至pUCm-T载体构建克隆质粒pUCm-α-BGT。克隆质粒经BamHⅠ、NotⅠ双酶切后连接至融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,成功构建融合基因表达载体pGEX-α-BGT,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。表达产物经15%SDS-PAGE分析,在约34ku处可见明显的外源蛋白质表达带,与预计的分子量大小一致,其表达量约占细菌总蛋白的32.6%。Westernblotting和间接ELISA检测结果表明,α-BGT的融合表达蛋白与天然α-BGT标准品具有相似的抗原性。 相似文献