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1.
本研究将人工合成的犬干扰素α2成熟区序列插入原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组表达质粒p ET-28a-Ca IFN-α2;然后将该质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态中进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,分子量约为23 k Da的目的蛋白表达,表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,表达量约占菌体总蛋白的52.5%。包涵体蛋白经变性、复性和纯化处理后,获得的重组Ca IFN-α2纯度为92%;用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测重组蛋白的抗病毒活性为3.16×106/m L。本研究结果为进一步研制新型犬用干扰素制品奠定了物质基础。 相似文献
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以全长PRV基因组DNA为模板,PCR法扩增截短的伪狂犬病毒VP5基因,将其克隆至p ET-28a载体中,构建重组原核表达质粒p ET-28a-VP5,转化至大肠杆菌BL21中,并诱导表达;表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果表明,重组表达蛋白可以与PRV阳性血清及标签HIS单克隆抗体发生特异性反应。通过成功构建了PRV截短VP5基因重组原核表达质粒p ET-28a-VP5,原核表达并纯化了重组蛋白,为伪狂犬病毒特异性诊断抗原的开发、疫苗的研制及细胞生物学研究奠定了基础。 相似文献
3.
《黑龙江畜牧兽医》2017,(11)
为了给原核表达牛分枝杆菌Fix B、Hsp X和MPB83基因并纯化Fix B、Hsp X和MPB83蛋白,进一步研究它们在牛结核病诊断中作为特异性抗原的诊断价值及应用奠定基础,试验用PCR方法从牛结核分枝杆菌AF2122/97基因组中扩增出Fix B、Hsp X和MPB83基因片段,构建p ET-28a-Fix B、p ET-28a-Hsp X和p ET-28a-MPB83重组质粒,克隆到DH5ɑ感受态细胞,提取测序正确的阳性重组质粒,转化BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG于37℃诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式,Western-blot分析鉴定并用Ni-NTA层析柱纯化蛋白。结果表明:成功扩增了大小依次约为957 bp、435 bp和663 bp的Fix B、Hsp X和MPB83基因,将其连接p ET-28a原核表达载体,原核表达的Fix B、Hsp X和MPB83重组蛋白均以包涵体形式存在,分子质量依次约为37 ku、21 ku和28 ku。经Western-blot鉴定表达产物为Fix B、Hsp X和MPB83重组蛋白,Ni-NTA成功洗脱出目的蛋白。说明试验成功构建了牛分枝杆菌Fix B、Hsp X和MPB83基因的原核表达载体,并纯化了Fix B、Hsp X和MPB83重组蛋白,可用于进一步的应用研究。 相似文献
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为探索十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis)谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GDH)在滋养体中的分布和酶动力学等生物学特性，对GDH进行了克隆并构建原核表达质粒pET-28a-GDH,然后转化至BL21(DE3) plysS感受态细胞中经IPTG诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析，以Ni2+亲和层析纯化。对纯化的重组GDH进行体外酶动力学分析并免疫小鼠制备多克隆抗体，最后用间接免疫荧光技术对滋养体中的GDH进行定位。结果显示，贾第虫GDH的编码序列长1 350 bp,试验成功构建pET-28a-GDH重组表达质粒并诱导表达，重组蛋白约为49.7 ku,且大部分以可溶性形式存在。ELISA和Western blot结果表明，贾第虫GDH具有良好免疫原性，获得的多克隆抗体具有较强特异性。间接免疫荧光定位显示GDH主要位于滋养体的胞质中。酶动力学研究结果显示，GDH最适反应pH约为9.3、最适温度约为42℃,对L-谷氨酸和NADP+的Km值分别为4.485 mmol... 相似文献
5.
从鸡胚原代细胞CEF中扩增出鸡HMGB1基因,构建重组原核表达质粒p ET-28a-ch HMGB1,并将p ET-28a-ch HMGB1转入大肠杆菌BL21(DE3)中,于37℃进行诱导表达,经SDS-PAGE分析表明该重组蛋白可以在大肠杆菌中高效表达且以可溶性蛋白的形式存在。蛋白通过Ni-NAT纯化树脂亲和纯化,并作为免疫原制备鼠抗ch HMGB1多克隆抗体血清。该多克隆抗体同时具有ELISA、Western blot和IFA效价,且特异性识别禽源细胞内HMGB1蛋白。 相似文献
6.
《中国兽医杂志》2016,(8)
根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化,全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒p ET-23b-Ch IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化。表达产物经SDS-PAGE、WesternBlot分析表明,Ch IFN-α蛋白得到了高效表达,其蛋白分子质量约19 k D,经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白,其含量为0.82 mg/m L。本研究为鸡α干扰素的生物学活性分析和临床产品研发奠定了基础。 相似文献
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本试验对猪脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）2A蛋白进行原核表达和纯化。采用大肠杆菌原核表达系统,将EMCV 2A基因插入原核表达载体pET-28a-sumo中构建重组原核表达质粒pET28a-EMCV-2A,经PCR和测序鉴定无误。将重组原核表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,超声破碎后,2A蛋白的表达主要以包涵体形式存在。通过优化蛋白表达条件,使目的蛋白能够实现可溶性表达。利用磁珠纯化方法对重组蛋白进行纯化,并以SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,本试验成功构建2A的重组表达质粒;重组蛋白分子质量约为25 ku,与预期大小一致;IPTG浓度1.0 mmol/L、16 ℃低温诱导16 h为最佳诱导条件,约有50%的蛋白呈现可溶性表达;纯化后获得2A重组蛋白。本试验通过对EMCV 2A蛋白的原核表达及纯化,成功获得纯度较高的EMCV 2A蛋白,为进一步阐明EMCV的分子致病机制以及研发基因疫苗和抗病毒药物奠定基础。 相似文献
10.
《广东畜牧兽医科技》2021,46(3)
本研究旨在构建鸡传染性支气管炎病毒(IBV)原核表达体系,制备其S1目的蛋白,为建立IBV ELISA检测方法奠定基础。以IBV QX型基因为模板,PCR扩增出S1蛋白基因,连接至p ET-32a原核表达载体,获得重组质粒p ET(32a)-S1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞后进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,重组S1蛋白在大肠杆菌BL21中获得表达,分子量约为60 k Da。Western-blot分析表明,重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应。利用Kcl染色法,成功纯化S1目的蛋白。本研究成功构建了p ET(32a)-S1重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中获得表达,为进一步制备S1蛋白抗体奠定了基础。 相似文献
11.
旋毛虫G10-7基因在大肠杆菌中的高效表达 总被引：4，自引：0，他引：4
旋毛虫新生幼虫期特异性 G10 - 7基因从 PBK- CMV- G10 - 7重组质粒中亚克隆到 p ET- 2 8b( )原核表达载体上 ,成功地构建了重组表达质粒 p ET- 2 8b- G10 - 7。将其转化到大肠杆菌 DE3感受态细胞中 ,经 IPTG诱导表达 ,其细菌裂解物经 SDS- PAGE电泳可检测到相对分子质量约为 34 0 0 0的目的蛋白带 ,且随诱导时间的延长蛋白表达量逐渐增加 ,诱导 4h达到峰值 ,薄层扫描结果显示 ,目的蛋白占菌体总蛋白的 6 1.7%。Western- blotting检测显示 ,此蛋白可被感染旋毛虫家猪阳性血清所识别 ,表明该蛋白具有良好的抗原性。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2017,(3)
为了制备产气荚膜梭菌致病性毒力因子α毒素的单克隆抗体,试验采用PCR法获得α毒素基因,克隆入原核表达质粒p ET-30b,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,构建表达α毒素的重组菌BL21/p ET-30b-α;IPTG诱导重组菌表达,并进行SDS-PAGE分析,以纯化的重组α毒素蛋白为免疫原免疫Balb/c小鼠,经筛选、亚类鉴定及特异性试验检测单克隆抗体。结果表明:重组菌表达的α毒素蛋白分子质量约为43 ku;杂交瘤细胞株3C5能够稳定分泌抗α毒素单克隆抗体,单克隆抗体亚型为Ig G2a型,能够特异识别产气荚膜梭菌天然α毒素蛋白。说明制备的单克隆抗体具有良好的反应原性。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2014,(1)
为了研究鸭α-干扰素在真核和原核中表达的不同,试验构建真核重组质粒Duifnα-pPICZα在巴斯德毕赤酵母X33株中实现高效分泌表达,构建原核重组质粒pET24α-Duifnα在大肠杆菌DH5α中表达蛋白,His·Tag包涵体蛋白纯化得到高纯度蛋白液,并进行了SDS-PAGE检测。结果表明:鸭α-干扰素分子质量为21 ku,通过鸭胚测得真核重组质粒表达的鸭α-干扰素能抑制水泡性口炎病毒(VSV)对鸭胚细胞的攻击,最高效价达1×105U/mL;通过IPTG诱导实现高蛋白表达,表达的量比真核质粒表达的多,纯化后的原核重组质粒表达的鸭α-干扰素也能抑制VSV对鸭胚细胞的攻击,最高效价达1×106U/mL。说明原核表达蛋白的活性比真核高10个单位。 相似文献
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为原核表达猪带绦虫腺苷酸激酶(ADK),对其免疫性进行初步研究,本研究以猪带绦虫成虫cDNA质粒文库中ADK同源基因重组质粒为模板,通过PCR扩增并将其亚克隆于原核表达载体pET28a(+),构建了pET-Ts-ADK重组质粒,经IPTG诱导表达,并通过SDS-PAGE鉴定,表明重组蛋白约30ku。经His-镍蛋白纯化柱纯化后western blot试验表明该重组蛋白可被猪带绦虫、亚洲带绦虫及牛带绦虫患者血清识别,表明猪带绦虫ADK基因在原核表达系统中表达获得的蛋白具有免疫反应性。 相似文献
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为制备兔抗ASFV pK145R蛋白的多克隆抗体,本研究以中国首次分离的ASFV HLJ/18毒株K145R基因的真核表达质粒p CAGGS-Flag-K145R为模板扩增K145R基因,构建重组原核表达质粒p ET-21a-K145R,利用镍亲和层析预装柱纯化p K145R蛋白并免疫新西兰大白兔,制备兔抗ASFV pK145R蛋白多克隆抗体,并通过免疫印迹（WB）、间接免疫荧光（IFA）及免疫沉淀（IP）试验对该抗体进行验证。结果显示：本研究成功构建了原核表达质粒p ET-21a-K145R,将该质粒转化细菌BL21(DE3)获得能够可溶性表达p K145R蛋白的重组菌,分子量约为16.0 kDa;利用高度纯化的ASFV pK145R蛋白,制备了兔抗ASFV pK145R蛋白的多克隆抗体,该抗体能够特异性地识别HEK293T细胞中瞬时表达的Flag-K145R蛋白和ASFV感染猪肺泡巨噬细胞中表达的ASFV K145R蛋白。本实验为深入研究p K145R蛋白的功能及其在ASFV感染致病性中的作用奠定了基础。 相似文献
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鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的原核表达及生物学活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
通过PCR方法扩增不含信号肽的鸡GM-CSF成熟蛋白基因,克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,构建原核表达质粒p32GM-CSF,通过IPTG诱导重组鸡GM-CSF蛋白表达,经镍离子亲和层析纯化后,用MTT法检测表达重组蛋白的生物学活性,并制备兔抗鸡GM-CSF多克隆抗体。结果表明成功地构建了p32GM-CSF原核表达质粒,SDS-PAGE结果显示表达的重组蛋白约34 ku,主要以包涵体形式表达,纯化后得到高纯度目的蛋白。West-ern Blot结果表明,该重组蛋白能与制备的抗鸡GM-CSF抗体特异性结合。MTT试验证实,该重组蛋白具有明显增强鸡骨髓细胞增殖的生物学活性;这些研究结果表明,表达的重组chGM-CSF蛋白及其多克隆抗体拥有相应的生物学功能,这将为进一步研究鸡GM-CSF蛋白的生物学功能及其应用奠定基础。 相似文献
17.
猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A的克隆和原核表达 总被引：2，自引：1，他引：1
原核表达猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A(catabolite control protein A,ccpA)并进行纯化,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。采用PCR方法,扩增ccpA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21中进行诱导、表达和亲和层析纯化;经Western blotting初步评价ccpA的抗原性。重组原核表达质粒pET-28a-ccpA经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约38000,能被相关抗体所识别。因此,能成功在大肠杆菌中表达猪链球菌2型ccpA,为猪链球菌2型相关调节蛋白的免疫学研究奠定基础。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2016,(3)
采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。 相似文献
19.
本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。 相似文献
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本文旨在通过原核表达获得猪磷酸酪氨酸互作结构域1(p PID1)重组蛋白,并制备p PID1多克隆抗体。将p PID1基因插入p ET28a(+),构建重组p ET28a(+)-p PID1大肠杆菌表达质粒,然后将重组质粒p ET28a(+)-p PID1转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,获得的重组子以不同异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度、温度和时间诱导,确定p PID1融合蛋白表达的最适条件。将表达产物经镍离子-亚氨基二乙酸(Ni2+-IDA)亲和层析纯化后进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MSMS)鉴定。同时,将纯化获得的p PID1融合蛋白免疫SD大鼠,制备p PID1多克隆抗体,并检测抗体效价。结果表明:p PID1融合蛋白表达的最佳条件为30℃以0.1 mmol/L IPTG诱导4 h;纯化的融合蛋白经MALDI-TOF-MSMS鉴定为p PID1;特异性的p PID1多克隆抗体成功制备,抗体效价为1∶20 480。本试验成功制备了高纯度的重组p PID1及其多克隆抗体。 相似文献