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1.
猪α干扰素的原核表达及抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究高效广谱的基因工程抗病毒制剂,本研究采用PCR技术自猪肝脏总DNA中扩增、克隆猪α干扰素（PoIFN-α）成熟肽基因并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪α干扰素（rPoIFN-α）蛋白通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用细胞病变抑制法分别测定rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗水泡性口炎病毒（VSV）增殖活性及在Marc-145细胞上抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的增殖活性,以分别评价rPoIFN-α的活性单位及其体外抑制高致病性PRRSV增殖所需的最低浓度。结果表明,克隆的PoIFN-α成熟肽基因全长501bp,编码166个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子量大小20.7ku左右,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白纯度在95%以上;纯化的rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗VSV病毒活性单位为1.4482×10^4IU/mL（5.2×10^6IU/mg）,在Marc-145细胞上能完全抑制高致病性PRRSV增殖所需的rPoIFN-α蛋白最低有效剂量为640U/mL（2.3×10^4U/mg）。这些研究结果为新型基因工程抗病毒制剂的开发以及用于高致病性PRRSV性疾病的预防和治疗奠定了基础。 相似文献
2.
猪α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究 总被引：5，自引：1，他引：4
为了研究高效广谱的猪基因工程抗病毒制剂,作者采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将猪α干扰素(Porcine interferon alpha,PoIFN-α)与猪白细胞介素2(Porcine interleukin-2,PoIL-2)成熟肽基因连接,构建成PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因,并克隆入pGEM-T Easy载体,将PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体进行原核表达.通过尿素变性、复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rPoIFN-α-linker-PoIL-2)进行纯化.采用细胞病变抑制法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中的PoIFN-α在不同细胞系上对不同病毒增殖活性的抑制作用;分别采用MTT法和PoIL-2 ELISA试验方法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中PoIL-2的生物学活性.结果表明成功构建并克隆PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因.嵌合基因在大肠杆菌中得到高效表达,表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白相对分子质量约36.7 ku,蛋白经纯化后纯度在96%以上.rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在细胞上具有与单一rPoIFN-α蛋白相近的抑制病毒增殖活性,其中在PK-15细胞上抗VSV的活性单位为1.891×104 IU·mL-1,在Marc-145细胞上抑制高致病性PRRSV增殖的活性单位为905 U·mL-1;rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有与单一rPoIL-2蛋白对照相近的生物学活性,可明显促进CTLL-2细胞的增殖,并可与抗PoIL-2单抗发生特异性免疫反应.这表明rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有rPoIFN-α和rPoIL-2蛋白双重的生物学活性,为基因工程抗病毒制剂的开发以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征等病毒性疾病的预防和治疗等研究奠定了基础. 相似文献
3.
为了探究重组猪干扰素(PoIFN-α)在体内外的抗病毒活性，利用pET-32a载体系统，构建了PoIFN-α的原核表达体系。在体外，MTT法在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)上测定了其细胞毒性，并利用细胞病变抑制法测定其抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的活性，同时测定了重组蛋白作用PK-15细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平；之后通过小鼠攻毒保护试验，测定了rPoIFN-α治疗后各组织器官的病毒载量，ELISA测定了小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的动态变化，并对整个试验期间小鼠出现的临床症状进行打分。结果显示，成功获得了原核表达的特异性重组蛋白rPoIFN-α,在细胞上抗病毒比活性达到1.67×106 IU,对细胞没有损害作用，且显著上调了Mx1、OAS等因子的转录水平；在小鼠体内能明显拮抗EMCV和PRV的增殖，减少促炎因子的产生，延缓临床症状的出现。结果表明，原核表达重组蛋白rPoIFN-α在体内外均具有抗病毒活性，为进一步推进蛋白药物在临床上的应用奠定了基础。 相似文献
4.
猪α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达 总被引：12，自引：0，他引：12
将猪α干扰素(PoIFN-α)基因克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,电转化毕赤酵母KM71H菌株,抗生素ZeocinTM浓度梯度筛选高抗性转化子,以PCR鉴定阳性重组菌株。筛选出的高拷贝重组菌株分别通过BMGY/BMMY培养基和YPG培养基,用甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot印迹杂交结果证实,表达产物为重组PoIFN-α融合蛋白,经细胞毒性试验检测(WISH/VSV系统),表达产物的抗病毒活性为4.1×104IU/mL。 相似文献
5.
为获得高效表达的重组猪β干扰素,在保留编码蛋白序列的同时,对PoIFN-β基因进行毕赤酵母偏嗜性改造,使基因序列G+C的含量增加到最大限度,并将其终止密码子改为TAA.构建了酵母表达裁体pPICZαC-PIB.pPICZαC-PIB经Sac Ⅰ酶切线性化后电转导入毕赤酵母菌株X-33.对PCR鉴定为阳性的酵母菌株进行高抗性筛选,获得1株高效表达PoIFN-β酵母菌株,其表达量约258.3 mg/L,是未经密码子改造菌株表达产物的3.4倍.经SDS-PAGE和Western blotting检测,表达产物为相时分子质量约22 000和24 000的蛋白,两者均可与抗PoIFN-β阳性血清发生特异反应.将表达产物进行氨基酸测序,测得2段随机肽段与PoIFN-β的氨基酸序列完全一致.在VSV-Vero系统上检测重组PoIFN-β对水泡性口炎病毒在Vero细胞中增殖的抑制作用,其抗病毒活性为1.88×106IU/L,是未经密码子改造菌株表达产物抗病毒活性的5.6倍.用MTT法检测PoIFN-β对猪外周血淋巴细胞成熟的影响,结果表明.猪重组PoIFN-β能有效刺激淋巴细胞转化,具有良好的免疫学活性. 相似文献
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为获得稳定表达重组猪α6干扰素的毕赤酵母。人工合成Po IFN-α6基因片段,连接至pPICZαA质粒,构建PoIFN-α6毕赤酵母表达质粒pPICZαA-PoIFNα6;经Sac I酶线性化后转化至毕赤酵母X33感受态细胞,筛选阳性克隆;优化毕赤酵母表达条件,并对表达产物进行了体外抗病毒活性测定。结果表明,成功构建了表达重组猪α6干扰素的毕赤酵母,以1%甲醇诱导72 h后,菌体上清SDS-PAGE可见20 kDa左右目的条带,Western blot检测为阳性;表达的重组猪干扰素α活性在PRRSV/Marc-145、VSV/MDBK、PRV/Vero、PEDV/Vero、PPV/PK-15、PCV2/PK-15和TGEV/PK-15系统中均具有良好的抗病毒活性。说明PoIFN-α6在细胞上清中表达成功,并且在不同宿主细胞中均有抗病毒活性。 相似文献
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重组猪α-干扰素喷干粉剂的制备及其效果评价 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备一种高活性、低价格重组猪α-干扰素（PoIFN-α）,采用喷雾干燥技术制备出重组猪α-干扰素（rPoIFN-α）喷干粉剂,并通过对rPoIFN-α喷干粉剂的稳定性,安全性,治疗效果等质量标准进行综合评价。结果显示,本试验制备的重组猪α-干扰素喷干粉剂质量稳定性,有效期暂定为两年;除10倍剂量rPoIFN-α喷干粉剂导致猪肝脏轻微脂肪样病变,其余各较低剂量rPoIFN-α喷干粉剂对猪无毒副作用;人工感染和临床应用试验表明rPoIFN-α喷干粉剂对猪腹泻具有显著的治疗效果。以上试验结果为PoIFN-α喷干粉剂的工程化生产及其在养猪业中的应用打下了基础。 相似文献
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9.
本研究根据GenBank上登录的猪β-干扰素基因成熟肽核苷酸序列(mPoIFNβ),在保持原猪β-干扰素蛋白序列不变的基础上,对猪β-干扰素基因进行了毕赤酵母偏嗜性改造,并构建了毕赤酵母重组表达质粒pPICZαC-PoIFNβ。pPICZαC-PoIFNβ经SacⅠ酶切线性化后,电击转化导入感受态的毕赤酵母菌株X-33中,转化子经YPDS+Zeocin抗性平板筛选和PCR鉴定后获得多株阳性菌株。阳性酵母菌株经甲醇诱导分泌表达了重组PoIFNβ,其表达量约为127.9 mg/L。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,结果表明,表达产物为分子质量约25和28 ku的混合物,并且二者都可与PoIFNβ阳性血清结合。以细胞病变抑制法测定重组β-干扰素在BHK-21细胞上的抗水泡性口炎病毒活性为2.8×103 IU/mL;对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145细胞上抗病毒活性达到1.6×103 IU/mL。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(7):1261-1268
干扰素(interfern,IFN)是在特定的诱生剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白,具有广谱抗病毒活性。从江香猪源Ι型干扰素α2和Ⅱ型干扰素γ于生菜中融合表达及生物活性研究未见报道。本研究应用生菜植物表达系统,将从江香猪源干扰素植物表达载体PBI121-IFNα2、PBI121-IFNα2γ、PBI121-IFNγ、PBI121-Vec转入根癌农杆菌LBA4404中,用真空渗透法将携带干扰素质粒的根癌农杆菌感染生菜叶片;用β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)染色和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测从江香猪源干扰素在生菜叶片中的表达;用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-PCR)技术分析从江香猪源干扰素蛋白活性。结果显示:GUS染色和ELISA检测证明从江香猪源IFNα2、IFNα2γ、IFNγ在生菜中实现了表达;Q-PCR检测显示:在Marc-145细胞上从江香猪源干扰素蛋白对PRRSV的复制有明显抑制作用,在PK15细胞上从江香猪源干扰素蛋白对干扰素γ诱导蛋白30(interferon-gamma-inducible protein 30,IFI30)、2′-5′寡聚腺苷酸合成酶(2′-5′oligoadenylate synthetase,OAS)、抗黏液病毒蛋白(myxovirus resistance,MX)基因的mRNA水平的上调有一定的促进作用。本研究成功实现从江香猪源IFNα2、IFNα2γ、IFNγ在生菜中进行表达且表达蛋白具有生物学活性,为从江香猪源Ι型和Ⅱ型干扰素新复合型药物植物蛋白的开发利用提供参考依据。 相似文献
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利用RT-PCR方法从猪肝细胞总RNA中扩增出编码猪α干扰素基因,根据大肠杆菌偏嗜性及活性位点改造基因并克隆至原核表达载体p ET21a,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定。重组蛋白以包涵体形式表达,经变-复性及纯化处理后,获得多种不同基因型的高纯度猪α干扰素。用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定,结果表明经过基因改造的猪α干扰素(Po IFN-M6)具有更高抗病毒活性,约为2.97×108U/mg。本研究为猪α干扰素基因工程产品的研发及其在临床兽医的应用奠定基础。 相似文献
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为可溶性表达重组鸡粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(ChGM-CSF)与猪干扰素α1(PoIFNα1)融合蛋白,并研究其生物学活性,本研究分别提取鸡、猪肝脏细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增ChGM-CSF和PoIFNα1基因,经linker连接上述两种基因后将其克隆于pET-32a原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE和western blot检测融合蛋白表达产物。在ST细胞/VSV病毒测定系统以细胞病变抑制法滴定该融合蛋白的抗病毒活性;同时用MTT法检测其对鸡淋巴细胞增殖活性的促进作用。结果显示,PCR扩增并融合后的ChGM-CSF和PoIFNα1融合基因约为1000bp,构建重组表达载体后,诱导表达的rChGM-CSF-PoIFNα1融合蛋白分子量约55ku,主要存在于破碎菌体的上清中,表达量较高。Westernblot检测结果显示,该融合蛋白分别能够与ChGM-CSF多抗和PoIFNα单克隆抗体特异性结合,其抗病毒比活性约为1.1×10^6IU/mg,并且具有促进鸡淋巴细胞增殖的活性。本研究为rChGM-CSF-PoIFNα1重组融合蛋白的研制及其相关活性的测定提供实验依据。 相似文献
13.
《中国预防兽医学报》2019,(7)
为在生菜中瞬时表达从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β和IFN-β,检测其抗猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)的活性,本实验采用从江香猪源干扰素特异引物分别从p UCm-CJpoIFN-α2、p UCm-CJpoIFN-α2β、p UCm-CJpoIFN-β质粒中扩增IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β基因序列,分别克隆至植物表达载体p BI121中,构建含不同干扰素的重组质粒。将各质粒分别转化根癌农杆菌LBA4404,采用真空渗透法将携带重组质粒的根癌农杆菌感染生菜,经用GUS染色和ELISA方法检测从江香猪源干扰素在生菜叶片中的表达;用q PCR方法和细胞病变抑制试验检测生菜中表达的从江香猪源干扰素蛋白抗PRRSV的活性。结果显示:本实验构建了含从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β的植物表达载体PBI121-IFN-α2、PBI121-IFN-α2β、PBI121-IFN-β;GUS染色和ELISA检测结果显示从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中实现了瞬时表达;q PCR检测结果显示生菜中瞬时表达的从江香猪源干扰素蛋白在Marc145细胞中对PRRSV的复制有明显抑制作用;生菜中表达的从江香猪源IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β分别经4~7、4~9、4~7稀释在Marc145细胞中仍然能够抑制100 TCID_(50)PRRSV的致细胞病变作用。本实验实现从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中的瞬时表达且表达蛋白具有较强抑制PRRSV的复制作用,本研究为从江香猪源干扰素抗PRRSV新复合型药物蛋白的开发利用提供参考依据。 相似文献
14.
应用RT-PCR技术从多聚肌苷酸多聚胞苷酸(poly(I∶C))刺激的ST细胞中扩增猪干扰素-λ3(PoIFN-λ3)基因。基因序列分析表明,PoIFN-λ3基因全长为588bp,与绵羊IFN-λ3基因(XM_004015683)的同源性最高(87.6%);分子遗传进化树分析表明猪IFN-λ3与牛、绵羊亲缘关系最近,与马、人、黑猩猩和鸡的亲缘关系次之。将PoIFN-λ3成熟肽序列定向插入pET-32a载体,转化宿主菌Rosetta gami B,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测分析表明,PoIFN-λ3基因获得表达,重组蛋白大小为32 000,以包涵体形式存在。重组蛋白经变性、纯化、复性后,用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性的测定。结果显示,复性后重组蛋白的含量约为1g/L,抗水泡性口炎病毒(VSV)活性达到2×103 U/mg,表明重组poIFN-λ3具有较高的抗病毒作用。 相似文献
15.
为进一步探究羊干扰素α和γ的抗病毒活性效果，根据GenBank羊IFN-α和IFN-γ基因序列，使用Linker连接合成目的序列，成功构建了3种重组表达质粒pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α、pET28a-OviIFN-γ/α并进行原核表达。用细胞病变抑制法和RT-qPCR测定重组蛋白rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ的抗病毒活性。结果表明，rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ在牛肾细胞(MDBK)以及非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞中有抗病毒活性，且rOviIFN-α/γ的抗病毒效果最优；rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ能够显著上调MDBK以及Vero细胞中4种干扰素刺激基因(IFN stimulated genes, ISGs)的mRNA转录水平，且rOviIFN-α/γ对干扰素刺激基因的上调水平最显著。综上所述，本试验表达的重组蛋白都具有抗病毒作用，其中串联表达的重组蛋白抗病毒活性以及干扰素刺激基因转录水平较高。 相似文献
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利用PCR技术从猪瘟免疫猪血中提取基因组,并从中扩增出约500 bp的基因片段;将此基因片段克隆于大肠杆菌pMD18-T载体,经PCR、测序鉴定后,将其片段克隆于pET32a(+)载体进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明,猪α干扰素在pET32a原核表达载体中成功地获得了分泌表达,且表达蛋白在PK-15细胞上表现出较强的抗病毒活性,这为进一步研究猪α干扰素的功能和开发奠定了基础. 相似文献
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为了表达猪重组α干扰素(rIFN-α)并对它的生物学特性进行研究,本研究采用RT-PCR从猪脾淋巴细胞中扩增出猪IFN-α基因,以pPROExHTa为载体构建了表达重组质粒polFN-α,转化宿主菌BL21,经IPTG诱导猪rIFN-α获得了表达,其分子量约22 ku.该重组蛋白以包涵体形式存在,其表达量占总菌体蛋白7%.粟用Ni-Ni金属螯合亲和层析方法纯化,其纯度达到80%以上,包涵体经复性后,在WISH/VSV系统上,采用细胞病变抑制法测定表明,其稀释度在小于1:103时才有抗病毒活性.本实验表达的猪rIFN-α具有一定的抗病毒活性,为研究具有广谱抗病毒效应的猪干扰素具有重要意义. 相似文献
18.
猪α干扰素具有抗病毒作用,临床上具有广阔的应用前景.为获得重组猪α干扰素,本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪α干扰素基因插入供体质粒pFastBac~(TM) Ⅰ多克隆位点,置于pH启动子控制下,在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化.将重组转移栽体质粒转化DH10感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒.重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blotting证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得表达.镍亲和层析柱纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳相对分子质量为19 000.通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制猪水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测其抗病毒活性为9.67×10~4 U/mL.昆虫培养上清及细胞裂解液经2~8稀释在Mare-145细胞上能够抑制猪蓝耳病病毒增殖.从而为进一步作为抗病毒药物应用于猪疫病的防治研究奠定了基础. 相似文献
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猪α-干扰素表达系统及其应用的研究进展 总被引：1，自引：1，他引：0
就猪α-干扰素的分子特征、生物学特性、表达系统和猪基因工程α-干扰素的应用进行综述,以期为猪α-干扰素在广谱抗病毒活性、抗肿瘤以及免疫调节的临床应用提供参考。 相似文献
20.
用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-IFN-α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子量大小约为43ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。重组吉林白鹅α干扰素经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在鸭胚成纤维细胞上抗鹅细小病毒的活性为3.32×105 U/mg,本试验结果表明,该表达系统能够表达重组鹅α干扰素,且表达的重组鹅α干扰素具有一定的抗病毒活性。 相似文献