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1.
《中国畜牧兽医》2020,(4)
试验旨在对转座酶Tn3的酶活力提高和进化进行初步探索。采用PCR扩增、限制性酶切、DNA连接、重组质粒的转化、易错PCR的优化及构建、D值的测定、酶切鉴定方法对转座酶Tn3进行体外定向进化研究。结果表明,用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒进行酶切,得到了450 bp的酶切产物;在含有卡那霉素的LB培养基培养菌体24 h,测量其D值,经过3轮重复性的研究,其D值和增殖能力从开始的0上升至0.18、0.42、0.60,说明Tn3活性有了明显的提高;将筛选得到的进化型重组质粒进行质粒抽提,用内切酶XhoⅠ和XbaⅠ进行双酶切鉴定,发现进化型重组质粒酶切产物条带相对较小;之后对进化型重组质粒进行基因测序分析,发现Tn3基因序列的多个位点发生了突变以及Tn3-Gal4靶向序列中间的CCR5-delta32基因被切除。说明成功完成了转座酶Tn3基因的克隆;确立了易错PCR的最优反应体系;选择卡那霉素作为筛选标记对进化型Tn3进行筛选,初步验证利用含有卡那霉素的LB培养基和对菌液D值的测定来进行筛选是可行的;Tn3基因序列突变和基因敲除,说明不论是在功能上还是在基因序列上Tn3都发生了改变,这种变化正是向着需要的方向进行的。 相似文献
2.
为研发一种更安全、有效的结核病疫苗,用于预防并清除结核病,本试验构建4株分别表达Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重组卡介苗,参考pMV261载体序列和Tuberculist上登录的H37Rv序列设计引物,通过PCR扩增和无缝克隆技术构建含Ag85基因片段的重组pMV261质粒。分别对重组质粒进行PCR、双酶切鉴定后,通过电击转化转染到卡介苗感受态细胞中,利用Kan耐药基因筛选获得重组卡介苗菌株。采用PCR及Western blotting鉴定Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因在卡介苗中的表达,再对构建成功的重组卡介苗进行培养,用于后续试验。PCR扩增结果表明,构建的重组卡介苗rBCG/Ag85A、rBCG/Ag85B、rBCG/Ag85C和rBCG/Ag85D目的基因片段大小分别为1 447、1 402、1 453和1 330 bp,与预期大小一致,表明目的基因已成功整合到卡介苗中;Western blotting结果表明,Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因均可在卡介苗细胞内成功表达。本试验利用基因工程技术成功获得4株分别表达Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重组卡介苗,将其分别命名为rBCG/Ag85A、rBCG/Ag85B、rBCG/Ag85C、rBCG/Ag85D。本研究可为进一步将其他抗原基因插入卡介苗细胞构建重组疫苗及疫苗研究提供材料。 相似文献
3.
经PCR、克隆鉴定、酶切获得PPVZ带有PvuⅡ酶切位点的TK1基因片段。将带有PvuⅡ酶切位点的TK1基因片段与经相同酶切的PUC19载体片段连接,获得重组质粒PUC19-Z。用限制性内切酶NcoⅠ对阳性重组质粒PUC19-Z进行单酶切(TK基因内存在一个NcoⅠ位点),经PCR、克隆鉴定、酶切获得质粒pGJP-5带有NcoⅠ酶切位点的P7.5基因片段,将此片段与经同样酶切的PUC19-Z连接,经酶切和PCR鉴定,筛选出正向插入的重组质粒即为鸽痘病毒插入载体。 相似文献
4.
应用特异性引物,从鸽新城疫F基因重组质粒pMD-18T-PPMV-1-F中PCR扩增F基因,用EcoRⅠ和NotⅠ分别对扩增产物和酵母表达质粒pPIC9K进行双酶切,将F基因定向克隆到pPIC9K的EcoRⅠ和NotⅠ位点,构建重组质粒pPIC9K-PPMV-1-F,对重组质粒鉴定后用SalⅠ酶切使其线性化,电击转化至感受态毕赤酵母GS115菌中,影印接种法筛选G418抗性菌株,提取酵母染色体DNA进行PCR鉴定,筛选出鸽新城疫F基因的高拷贝重组菌株。 相似文献
5.
根据GenBank中已发表的犬新孢子虫SAG1基因序列(AF132217),设计了一对含有Kozak序列、起始密码子、终止密码子、BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物。以含有SAG1基因的重组质粒pMD-18T-SAG1为模板,经PCR扩增获得SAG1基因,利用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切该片段,回收含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点粘性末端的SAG1基因片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAX1真核表达载体中,获得重组质粒pVAX1-SAG1,经PCR鉴定、酶切分析和重组质粒的序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。 相似文献
6.
为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。 相似文献
7.
牛疱疹病毒Ⅰ型gB、gE基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建 总被引：2，自引：1，他引：1
本试验用PCR方法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型(bovine herpesvirus-1,BHV-1)Bartha Nu/67株gB、gE基因片段,将其克隆到pGEM-T-easy载体。经转化、筛选、鉴定后将重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后,与经相同方法处理的杆状病毒转移载体pFastBacHTb连接,得到了重组质粒pFBHgB、pFBHgE。经酶切和测序鉴定后,将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性、蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到了含gB、gE基因的重组穿梭载体。 相似文献
8.
试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建法尼醇X受体（FXR）基因稳定敲除细胞株,并考察其对HeLa细胞增殖的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计3对特异性识别FXR基因第1外显子相关序列的上下游小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）,以PX459质粒为载体,构建真核重组表达质粒。酶切和测序鉴定后将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,再用实时荧光定量PCR检测HeLa细胞FXR基因敲除稳定株中FXR的表达量,并用Western blotting方法鉴定HeLa细胞FXR基因敲除效果。最后用结晶紫染色试验检测FXR基因敲除对HeLa细胞增殖的影响。结果显示,经测序后,3对sgRNA位置与方向均正确插入到PX459质粒载体内,成功构建出重组表达质粒PX459-sgRNA;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,转染后筛选出的细胞中FXR蛋白不表达,表明构建出稳定敲除FXR基因的HeLa细胞株;结晶紫试验结果发现,FXR基因敲除的HeLa细胞染色深度明显低于正常HeLa细胞,FXR基因敲除HeLa细胞孔D595 nm值极显著低于野生型HeLa细胞孔（P<0.01）,说明HeLa细胞FXR基因敲除株的增殖能力较正常HeLa细胞显著降低。本试验利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源FXR基因敲除细胞株,且FXR基因敲除对癌细胞增殖具有显著抑制作用,为研究FXR的功能和作用机制提供了细胞模型,并为研究FXR在相关癌症发生发展中的作用奠定了基础。 相似文献
9.
为筛选马鼻肺炎（equine rhinopneumonitis,ER）基因缺失减毒活疫苗的候选毒株,本研究参考GenBank中EHV-1（登录号：KF644579.1）目的基因序列设计同源臂引物,以本地区流行株XJ2015株DNA为模板PCR扩增gE基因同源臂gEH1、gEH1,以EGFP表达盒（CMV+EGFP+polyA）为标记基因,酶切后依次连接至载体pUC-19,成功构建重组质粒pUC-gEH1H2-EGFP。将XJ2015基因组与质粒pUC-gEH1H2-EGFP共转染至RK-13细胞进行同源重组,以EGFP为标记进行gE基因缺失毒株的筛选及纯化,并测定重组毒株效价。结果显示：经5轮荧光噬斑纯化、PCR及测序鉴定,成功获取一株携带EGFP基因的重组毒株XJ2015-△gE-EGFP,且重组毒株效价（107.1TCID50/0.1 mL）较原毒株（108.8TCID50/0.1 mL）下降约101.7TCID50/0.1 mL。采用同源重组技术成功构建了1株马疱疹病毒1型流行株gE基因缺失突变株,为未来筛选马鼻肺炎基因缺失弱毒疫苗奠定了基础。 相似文献
10.
FMDV结构基因P1的克隆与植物双元表达载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
通过RT-PCR法获得阿克苏(Akesu/O/58)FMDV结构基因P1,将该基因克隆到pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。将P1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pB in438,构建重组中间表达载体pB inP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pB inFMDV-P1。结果表明:P1基因为2 208 bp。重组中间表达载体pB inP1经BamHⅠ/SalⅠ双酶切、PCR扩增和序列测定,表明P1基因、Kozak序列等已插入pB inP1。在含50mg/L卡那霉素、25 mg/L链霉素和50 mg/L利福平的YEB培养基上筛选及对融合农杆菌质粒进行P1基因的PCR检测,证明植物双元表达载体pB inFMDV-P1构建正确。 相似文献
11.
根据已经克隆得到的MsZIP基因(GenBank序列号:HQ911778),扩增编码区cDNA,构建植物超表达载体PBI-MsZIP。酶切鉴定表明,目的基因已经正确的插入到载体中,超表达载体构建成功。采用CaCl2冻融法将其转入农杆菌菌株中,然后采用农杆菌介导的方法,转化紫花苜蓿,共得到11株抗性苗,对其中的4株进行卡那霉素基因PCR检测,均得到了目的条带。同时对这4株抗性苗进行目的基因的RT-PCR检测,均得到了目的条带。说明MsZIP基因已经成功在苜蓿中超表达。为了进一步验证该基因的功能,分别用200 mmol/L NaCl和25 μmol/L PEG-6000处理转基因苜蓿,3 d后进行生理指标的测定。结果表明,MsZIP基因在苜蓿中超表达可以提高苜蓿的耐盐性和耐旱性。 相似文献
12.
为提高胰高血糖素样肽-2（GLP-2）生产效率以适应畜牧生产应用的需求,本试验利用基因工程技术表达出定点诱变的p[Gly2]GLP-2。用甘氨酸取代GLP-2氨基末端第2位的丙氨酸后,再根据大肠杆菌的偏好性对p[Gly2]GLP-2序列进行优化并在目标肽序列N-端添加肠激酶识别位点,合成基因序列,通过Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点连接到pET-40b（+）构建原核重组表达载体p[Gly2]GLP-2-pET-40b（+）,重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达重组蛋白。优化后最适表达条件为：菌液D600 nm值为0.6时,用0.2 mmol/L IPTG在37℃诱导培养5 h;最终得到p[Gly2]GLP-2重组蛋白表达量较高的基因工程菌株。通过镍离子亲和层析柱纯化及分梯度洗脱获得纯度较高的p[Gly2]GLP-2融合蛋白,本结果为后续p[Gly2]GLP-2功能性的研究及其在畜牧生产的应用奠定了基础。 相似文献
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为了研究猪附红细胞体信号识别颗粒54（SRP54）基因的功能,试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体KI3806全基因组序列（登录号为NC015153.1）中信号识别颗粒（SRP）蛋白基因设计合成1对特异性引物,采用PCR方法扩增猪附红细胞体SRP54基因片段,将扩增产物克隆至pMD18-T载体上,重组质粒经PCR和酶切鉴定后测序,并将SRP54基因与pVAXⅠ真核表达载体连接。结果表明:克隆的SRP54基因片段长1 173 bp,与GenBank中原序列同源性为97%,构建的真核表达质粒pVAXⅠ-SRP54经PCR和酶切鉴定正确,为猪附红细胞体SRP54基因的后续研究奠定了基础。 相似文献
14.
本研究旨在对绵羊NYD-SP27基因进行克隆和原核表达，并对其表达的蛋白进行生物信息学分析。根据GenBank中绵羊NYD-SP27基因序列（登录号：KX905090）设计1对特异性引物，通过PCR方法扩增目的基因片段，构建pET-22b（+）-NYDSP27重组质粒并转化E.coli DH5α感受态细胞，提质粒进行双酶切鉴定，将鉴定正确的pET-22b（+）-NYDSP27重组质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达，对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定，并利用生物信息学方法对NYD-SP27基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示，试验成功扩增出大小为1 617 bp的NYD-SP27基因片段，并经NdeⅠ和Xho Ⅰ双酶切获得大小为5 400和1 617 bp的两条片段，表明成功构建了pET-22b（+）-NYDSP27重组质粒，诱导表达重组蛋白大小约60 ku，主要以包涵体的形式存在。NYD-SP27蛋白分子式为C2798H4319N737O819S19，原子总数为6 892，理论等电点（pI）为6.16，为酸性蛋白，不稳定系数为46.96，属于不稳定蛋白，总平均亲水性为-0.403。该蛋白无跨膜结构，无信号肽，含有45个潜在的磷酸化位点和24个抗原表位；NYD-SP27蛋白二级结构中的α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲分别占26.21%、3.90%、18.03%和51.86%。本试验结果可为深入研究绵羊NYD-SP27蛋白的作用机理提供理论依据。 相似文献
15.
【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号:KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp;pMD19-T-NMBR重组质粒双酶切为2条特异性条带,条带大小分别与pMD19-T质粒和猪NMBR CDS序列片段大小一致,表明成功构建pMD19-T-NMBR质粒;通过双酶切获得线性化的pCD513B-1和NMBR序列;RT-PCR和测序结果表明,成功构建慢病毒过表达载体pCD513B-1-NMBR;pCD513B-1-NMBR转染48 h后,HEK-293T细胞中呈现大量绿色荧光,表明病毒包装成功,病毒效价约为4×106 TU/mL;NMBR基因慢病毒转染猪Leydig细胞48 h后,80%以上细胞有GFP表达,表明大部分细胞成功转染慢病毒;实时荧光定量PCR检测结果表明,转染慢病毒后能够极显著增加NMBR mRNA的表达(P＜0.01)。【结论】本试验成功构建了猪NMBR基因慢病毒过表达载体,并证实猪NMBR基因过表达慢病毒能够增加猪Leydig细胞NMBR基因的表达,为研究NMBR基因过表达在猪Leydig细胞中的作用奠定基础。 相似文献
16.
This study was conducted to construct zinc finger and BTB domain containing 38 (Zbtb38) gene lentiviral overexpression plasmid vector.Firstly,the CDS sequence of mouse Zbtb38 gene was amplified by overlap extension PCR method using mouse spinal cord tissue,and the Zbtb38 CDS sequence front amplification primer 1 and the latter amplification primer 2 were designed respectively.Using the amplification products of the above two primers as template,primer 3 was designed and subjected to fusion PCR amplification,thereby obtaining the full CDS sequence of Zbtb38.Then,the obtained Zbtb38 gene CDS full sequence was ligated to the plasmid pGM-T,and the recombinant plasmid was transferred into E.coli DH5α competent cells,the positive clones were identified and verified by direct PCR and sequencing.Finally,the Zbtb38 CDS sequence was ligated into the lentiviral vector Plvx-puro by XhoⅠ and BamHⅠ double digestion to obtain the shuttle plasmid Plvx-puro-Zbtb38,which was co-transfected with lentiviral packaging plasmids to produce lentiviral particles in 293T cells.The results showed that the primer 1 amplification product contained the first 1-1 794 bp of the Zbtb38 CDS sequence,and the actual sequencing length of the amplified product was 1 772 bp.The primer 2 amplification product contained the 1 762-3 594 bp of the entire sequence of Zbtb38 CDS,and the actual sequencing length of the amplified product was 1 818 bp,indicating that the fragmented amplification target fragment was successfully obtained.The expected fusion products amplified by primer 3 and the PCR amplification products of the colonies both contained the complete sequence of Zbtb38 CDS (3 594 bp),which was compared with the CDS sequence of Zbtb38 gene in NCBI database,and the coincidence rate was 99.99%,indicating that the Zbtb38 CDS sequence was successfully amplified.The Real-time PCR results showed that the virus titer reached 3.25×108 Tu/mL,which met the experimental animal injection standard requirement,indicating that the lentiviral vector was successfully constructed.In summary,the mouse Zbtb38 gene lentiviral overexpression plasmid vector was successfully constructed in this experiment. 相似文献
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In the study,an indirect ELISA was developed using the purified thymidine kinase (TK) protein as antigens to detect the antibody of duck plague virus (DPV).The TK gene of DPV was amplified by PCR using specific primers designed according to the sequence of TK gene in GenBank.Using gene recombination technology,the TK gene was cloned and inserted into prokaryotic expression vector pET-32a and the recombinant plasmid was identified by PCR,double enzyme digestion and sequence analysis.The positive recombinant plasmid was then transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced by IPTG.The expressed protein was purified by gel extraction and analyzed by Western blotting.Then an indirect ELISA was established to detect DPV antibody by using the purified recombinant TK as the coating antigen.The other assay conditions were also optimized.The recombinant plasmid was constructed successfully and Western blotting detected the target protein,TK recombinant protein could be recognized by positive serum,and the result indicated that the recombinant protein had good antigenicity.The optimum reaction conditions were as follow:The optimal dilution of enzyme labelled antibody was 1:200,the optimal dilutions of antigen and antibody were 1:400 and 1:200,reaction time was 60 min,most prefer blocking solution was 5% BSA,closed for 60 min,chromogenic time was 10 min.The method had good stability and high sensitivity,and it could provide a reliable method for the clinical detection,immunization surveillance,and prevention and cure of DP. 相似文献
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本研究旨在以表达纯化的鸭瘟病毒胸苷激酶(thymidine kinase,TK)重组蛋白作为包被抗原,建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。根据GenBank上收录的鸭瘟病毒TK基因序列设计出1对引物,采用PCR扩增出鸭瘟病毒TK基因。将TK基因与原核表达载体pET-32a连接,通过PCR、双酶切和测序鉴定,将阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达。采用切胶纯化的方法纯化蛋白,Western blotting分析鉴定表达产物。用纯化的TK重组蛋白作为包被抗原,并优化其他条件,最终建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组质粒构建成功,经Western blotting检测得到目的蛋白,TK重组蛋白能被阳性血清识别,说明该重组蛋白具有较好的抗原性。确定了最佳反应条件:酶标二抗的最佳稀释度为1:200,最佳抗原、抗体的稀释度分别为1:400和1:200,抗原抗体作用时间为60 min,最佳封闭液为5% BSA,最佳封闭时间为60 min,最佳显色时间为10 min。结果表明,该方法具有良好的稳定性及较高的敏感性,为鸭瘟的检疫、监测和防制工作提供了一种有效的手段。 相似文献