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1.
《中国畜牧兽医》2020,(7)
为深入研究乙型脑炎病毒(JEV)NS1和NS1-2A蛋白的表达和免疫效果差异,本试验构建并扩增C-端含Flag标签的NS1和NS1-2A基因,利用T4 DNA连接酶分别连接到质粒pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag。将这两种真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,利用RT-PCR、IFA和Western blotting检测NS1和NS1-2A蛋白在体外的表达情况,用pcDNA3.1-NS1-Flag、pcDNA3.1-NS1-2A-Flag和pcDNA3.1(+)免疫BALB/c小鼠,检测这两种蛋白在体内的表达差异。结果显示,试验成功构建了NS1和NS1-2A基因的真核表达载体pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag,IFA和Western blotting鉴定NS1和NS1-2A蛋白成功表达,重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠后可诱发机体产生特异性体液免疫,pcDNA3.1-NS1-2A-Flag联合免疫组小鼠血清抗体效价和INF-γ细胞因子分泌水平比pcDNA3.1-NS1-Flag免疫组高,且与pcDNA3.1(+)空载体免疫组差异极显著(P0.01);pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫组小鼠体内的INF-γ分泌量会增多,免疫第4周达到最高后逐渐降低。pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠能够刺激JEV特异性抗体的分泌和增强机体的细胞免疫功能,且NS1-2A联合基因的免疫效果优于NS1单一基因,为进一步研究JEV的非结构蛋白功能、研发NS1和NS1-2A基因疫苗奠定基础。 相似文献
2.
为了解日本乙型脑炎病毒(JEV)强、弱毒株非结构蛋白的免疫效果,笔者分析了JEV强、弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A真核表达的差异。通过观察JE减毒活疫苗(SA14-14-2株)和JEV贵州分离株(GZ株)分别在BHK-21细胞上出现的CPE,并收集强、弱毒株的细胞悬液,提取总RNA,分别设计6对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A的编码基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-NS1r、pcDNA3.1(+)-NS2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1q、pcDNA3.1(+)-NS2Aq和pcDNA3.1(+)-NS1-2Aq,将构建成功的6种真核表达质粒免疫健康小鼠,最后采集小鼠的血液和组织分别进行JEV抗体检测和细胞免疫水平检测。研究结果显示:JEV GZ强毒株与JEV SA14-14-2弱毒株能在BHK21细胞上增殖并产生CPE现象;构建的6种真核表达质粒免疫小鼠后经血常规和T淋巴亚群检测可以极显著或显著增加CD4+和CD8+细胞的含量。表明JEV强毒株非结构蛋白所诱导的细胞免疫略优于弱毒株非结构蛋白诱导的细胞免疫,但差异不明显。本研究结果可为日本乙型脑炎病毒的病原基础研究提供参考。 相似文献
3.
4.
为建立稳定表达乙型脑炎病毒(JEV) NS1蛋白的真核细胞系,本研究将编码JEV NS1蛋白的人工合成基因克隆到真核表达载体pCAGG-TK-neo中,构建了重组质粒pCAGG-opti-NS1.重组质粒经脂质体转染RK-13细胞,以含G418的选择性培养基选择培养,经细胞克隆纯化,以间接免疫荧光试验(IEA)筛选表达目的基因的细胞.结果表明,转染的RK-13细胞经G418加压及IFA筛选后,获得表达JEV NS1蛋白的阳性RK-13细胞系.经RT-PCR、western blot和IFA鉴定,该细胞系在传代至第15代后仍然可以稳定表达NS1蛋白.本实验获得了能够稳定表达JEV NS1蛋白的细胞系,为进一步开展JEV相关的研究奠定了基础. 相似文献
5.
根据流感病毒A/Puerto Rico/8/34株NS1基因的核苷酸序列设计引物,PCR扩增后,将NS1完整开放阅读框分别克隆于pMX载体和PET30a载体,成功构建了pMX-PR8-NS1和PET-PR8-NS1重组质粒。将PET-PR8-NS1重组质粒转化Jm109感受态大肠杆菌,诱导表达获得重组NS1蛋白免疫小鼠制备多抗血清。同时,将逆转录病毒载体系统pMX-PR8-NS1、pCI-NF-KB、PMDSV和MDSV共转染293T细胞,制备逆转录病毒样粒子。将逆转录病毒样粒子感染MDCK细胞,利用嘌呤霉素进行抗性筛选。然后经过PCR、RT-PCR、间接免疫荧光鉴定,获得稳定表达PR8病毒NS1蛋白的细胞系,将之命名为MDCK-PR8-NS1细胞系。该细胞系的建立有望为深入开展流感病毒NS蛋白生物学功能的研究以及为扩增NS1基因删除的流感病毒提供了有利的工具。 相似文献
6.
为进一步开展猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）NS1蛋白功能研究,根据GenBank登录的PPV参考株NADL-2（登录号：NC001718）的NS1基因序列设计1对特异性引物,采用PCR技术扩增PPV疫苗株NS1基因,将PCR扩增产物克隆入pTA2载体构建重组质粒pTA2-NS1,并进行测序鉴定。测序结果显示,构建的pTA2-NS1质粒含有一个开放阅读框（ORF）,全长1989 bp,共编码662个氨基酸,与GenBank登录的PPV参考株NADL-2、Kresse株的NS1基因的核苷酸同源性分别为99.85%和99.65%,氨基酸同源性分别为99.70%和99.70%。上述结果表明试验成功构建了含有PPV NS1基因的重组质粒pTA2-NS1。应用DNAStar软件及在线ProtScale、SignalP 4.1、TMHMM、Scansite、PSORTⅡ等生物信息学软件对NS1基因及其编码蛋白进行生物信息学分析,结果显示NS1蛋白分子质量为75.7 ku,等电点PI为6.82,是弱酸性蛋白;NS1蛋白不含信号肽序列,无跨膜区,为可溶性蛋白,主要定位于细胞核内,T199、Y309、T338、T512、S631、T635为其潜在磷酸化位点。以上研究为进行PPV NS1蛋白表达,进一步开展NS1蛋白功能研究奠定了基础。 相似文献
7.
本研究在大肠杆菌中表达了日本乙型脑炎病毒(JEV)非结构蛋白NS3和NS5,并纯化NS3和NS5蛋白,免疫小鼠获得脾淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合筛选得到2株抗NS3蛋白单克隆抗体1H7和2D4,3株抗NS5蛋白单克隆抗体3C4、3H7和3F10。试验通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western blotting和间接免疫荧光检测(IFA)检测了单克隆抗体的活性。结果显示,所有的单克隆抗体1∶100稀释进行IFA和1∶500稀释进行Westernblotting时均具有高特异性和高敏感性。抗JEV NS3和NS5蛋白单克隆抗体的成功制备为进一步研究JEV的蛋白结构和致病性奠定基础。 相似文献
8.
通过构建蓝舌病毒(BTV)NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,转染HEK-293T细胞,利用Western blot及荧光显微镜分析NS4蛋白的表达与亚细胞定位特征;pcDNA3.1-NS4-eGFP转染的HEK-293T细胞添加20 HAU/mL仙台病毒(SeV)刺激后,qRT-PCR法分析NS4基因表达对SeV诱导的上游识别基因RIG-Ⅰ、MDA5、VISA、TBK1、IKKε、IRF3、TRAF3、TRAF6、IRF9、干扰素基因(IFN-α、IFN-β)以及干扰素刺激基因ISG15和USP18的mRNA表达水平的影响。在HEK-293T细胞内转染pcDNA3.1-NS4-eGFP质粒24 h后,分别添加20 HAU/mL SeV刺激24,48 h,qRT-PCR结果表明,细胞内表达NS4-EGFP后,RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15及IFN-β基因mRNA表达极显著下降,随着SeV诱导时间的延长,VISA、TBK1、IKKε、USP18基因mRNA表达差异呈不显著趋势。本研究成功构建BTV NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,NS4-EGFP融合蛋白在HEK-293T细胞中主要分布于细胞核周围及细胞核内。BTV NS4基因在HEK-293T细胞内的表达显著下调SeV诱导的IFN信号通路相关基因RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15和IFN-β的表达,为进一步探究NS4基因在BTV拮抗宿主细胞免疫应答中的机制奠定基础。 相似文献
9.
【目的】利用原核表达系统体外表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)NS5A基因,获得非结构蛋白NS5A,对其进行核苷酸、氨基酸序列分析,以解析BVDV非结构蛋白NS5A的功能。【方法】参考BVDV-1型毒株V006的NS5A基因序列(GenBank登录号:KX170647)设计并合成1对特异性引物,以分离到的牦牛BVDV GSTZ毒株cDNA为模板,PCR扩增NS5A基因片段,并克隆至表达载体pET-28a (+)中,构建重组原核表达载体pET28a-NS5A。经酶切初步鉴定及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,然后利用IPTG诱导表达。经10% SDS-PAGE电泳及Western blotting分析鉴定重组蛋白的表达,并根据NS5A基因的序列构建遗传发育进化树,利用DNAStar软件预测NS5A蛋白的亲水性、表面可塑性和抗原性等特性,并结合二级结构的预测对NS5A蛋白的B细胞抗原表位进行预测。【结果】PCR扩增NS5A目的基因片段为1 488 bp,双酶切和测序鉴定结果证明,重组质粒pET28a-NS5A构建成功。经10% SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定重组蛋白,表达出了大小为55 ku的目的蛋白,大小与预期结果相符。通过对不同BVDV毒株NS5A基因序列构建遗传发育进化树,显示GSTZ毒株NS5A在遗传进化特征上属于BVDV-1型。NS5A蛋白的亲水性主要位于12—21、32—69、75—113、120—135、143—147、152—163、165—180、215—230、265—274、296—340、348—378、389—447、455—463、469—495位氨基酸处,表面可塑性主要位于14—18、37—42、76—81、86—109、154—160、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373、414—442、430—437、454—460位氨基酸处,柔性区域较多,主要位于14—21、37—43、67—82、86—93、97—110、152—158、169—179、218—231、240—255、296—310、313—328、344—359、364—373、413—422和472—483位氨基酸处。NS5A蛋白的B细胞抗原表位主要位于15—18、76—81、154—158、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373和414—422位氨基酸处。【结论】成功表达并鉴定了牦牛源BVDV的非结构蛋白NS5A,系统发育进化树表明BVDV GSTZ株基因型属于BVDV-1型,NS5A蛋白具有良好的抗原性,为深入解析BVDV非结构蛋白NS5A的自身结构功能、免疫学特性以及进一步研究非结构蛋白对病毒复制的影响提供参考。 相似文献
10.
根据H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的NS1基因序列,设计1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增AIV的NS1基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32α（＋）中,构建重组表达质粒pET-32α（＋）-NS1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导得到NS1融合蛋白;其相对分子质量约28 000,分析显示NS1基因的原核表达载体成功构建,表达蛋白以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于NS1蛋白的功能,为建立鉴别禽流感疫苗免疫和野毒感染ELISA诊断试剂盒奠定基础。 相似文献
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本文通过对猪乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）基因组中移码序列分析，设计合成三条引物，通过PCR扩增出假定的NS1′移码片段，并将移码片段三倍重复克隆入pET-28a表达载体中。重组质粒转化E．coliBL-21后，经IPTG诱导在37℃下实现目的片段的可溶性表达。纯化表达产物，并免疫小鼠制备了多抗血清，以多抗血清为一抗，对JEv感染的Vero细胞进行免疫荧光分析，结果发现抗移码片段表达蛋白的血清可识别JEV蛋白。以JEV感染Vero细胞，提取感染细胞总蛋白，分别以NSl单抗和VAI-制备的多抗血清为一抗，进行Westernblot分析。结果显示，NS1单抗为一抗，可染出48kDa的NS1条带和56kDa的NS1′条带：而以多抗血清为一抗，仅染出56kDa的条带。上述结果显示，多抗血清识别的NS1′蛋白为NS1′移码后片段表达的蛋白。 相似文献
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为了表达流行性乙型脑炎（epidemic encephalitis type B）非结构蛋白NS1,本研究通过PCR扩增了日本乙脑病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）P3株NS1基因,并分别构建了其融合表达His和GST标签的原核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达了NS1融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting进行鉴定,并用尿素变性复性和镍亲合层析法纯化目的蛋白。结果显示,试验成功构建了NS1的两个原核表达载体pET-42b-NS1和pGEX-KG-NS1,P3株NS1基因全长1 056 bp,以包涵体的形式表达约40 ku的蛋白,尿素变性复性效果较好,镍亲合层析纯化得到纯度和浓度均较高的NS1蛋白。JEV NS1基因可以通过原核表达系统高效表达蛋白并纯化得到高纯度产物,为后期生物学功能研究奠定基础。 相似文献
13.
采用RT—PCR方法克隆猪流感病毒H3N2亚型NS1全长基因,构建NS1基因原核表达质粒pET-28a—NS1和真核表达质粒p3XFLAG—CMV—NS1,在大肠杆菌和真核细胞内表达NS1基因,制备抗NS1多克隆抗体。用所制备的抗体分析p3xFLAG—CMV—NS1转染表达NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。经终浓度为1mmol／L的IPTG诱导后,重组蛋白NS1在大肠杆菌中得到表达。表达蛋白纯化后免疫Wistar大鼠制备抗NS1蛋白多克隆抗体,Western—blot分析表明抗NS1多克隆抗体可以识别大肠杆菌表达的NS1蛋白、转染Veio细胞表达的NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。间接免疫荧光发现NS1蛋白主要定位于细胞核。结果显示,本试验成功构建了NS1基因原核和真核表达系统,获得了NS1特异性多克隆抗体,分析了NS1细胞定位,为进一步研究NS1蛋白在病毒复制过程中的生物学功能和猪流感病毒的复制机理奠定基础。 相似文献
14.
从北京地区疑似细小病毒感染的犬粪拭子中成功分离鉴定出14株犬细小病毒（CPV）毒株,并对其完整的VP2和NS1基因进行了序列分析。结果表明,鉴定到的14株CPV毒株中,7株为New CPV-2a型,7株为CPV-2c型。此外,NS1的19、33、293、588、624和656位氨基酸以及VP2的13、574位氨基酸为新鉴定的氨基酸突变位点。基于VP2、NS1基因的系统进化分析表明,大部分的New CPV-2a型和CPV-2c型毒株与广西南宁和吉林长春地区的分离毒株亲缘关系密切,说明本次分离毒株与广西或吉林地区分离毒株具有相同的起源。本研究为更好地开展犬细小病毒流行病学调查提供了有益借鉴,也为深入研究犬细小病毒变异和传播的分子机制奠定了基础。 相似文献
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日本乙誓脑炎病毒NS1基因及其疫苗的研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
日本乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒引起的严重的人畜共患传染病。乙型脑炎病毒的三种糖基化蛋白PrM、E和NS1是其主要免疫保护性抗原,其中PrM和E蛋白是日本乙型脑炎病毒的结构蛋白,其结构和相关疫苗研究的报道较多。NS1蛋白是日本乙型脑炎病毒的非结构蛋白,其主要参与病毒复制的早期阶段,推测可能参与病毒组装和释放。可诱导补体依赖性溶细胞反应,不能产生中和抗体,能诱发机体在非中和性抗体存在的情况下产生保护性免疫。在接种乙脑病毒的细胞的细胞内、细胞表面及上清液中均含有大量的NS1蛋白。对小鼠接种NS1蛋白或NS1蛋白特异性抗体,均能让小鼠产生对乙脑病毒感染的保护性免疫作用。本文主要就乙型脑炎病毒非结构基因NS1及其免疫疫苗的研究进展进行综述,为其更进一步深入研究IEV NS1基因及其相关疫苗奠定基础。 相似文献