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1.
《中国农业科学》2020,(20)
【目的】BOLL作为一个RNA结合蛋白,可通过与其他分子相互作用而在精子发生过程中发挥不可或缺的作用。研究旨在分析藏绵羊BOLL的序列特征及其在睾丸中的表达与分布模式,进而探究其表达调控与潜在的生物学功能,以期为进一步解读BOLL在绵羊精子发生中的作用机制提供必要的思路和分子见解。【方法】选取3月龄(性成熟前)、1岁龄(性成熟)和3岁龄(成年)3个关键发育阶段各8只健康的雄性藏绵羊。以睾丸组织总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆藏绵羊BOLL的完整编码序列(coding sequence,CDS)区;通过相关生物信息学软件对BOLL的序列与结构特征及其互作蛋白进行分析;采用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR), Western blot和免疫荧光染色法对BOLL在3个发育阶段睾丸组织中的表达和免疫定位特征进行检测;基于课题组前期有关藏绵羊睾丸组织全转录组测序数据,借助相关数据库进行绵羊BOLL的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络和功能注释分析,并采用qRT-PCR和双荧光素酶报告实验对其表达特征及靶向关系进行验证。【结果】藏绵羊BOLL CDS区全长为888 bp,可编码295个氨基酸,含有由81个氨基酸残基组成的RRM结构域(靠近N端)和25个氨基酸残基组成的DAZ重复基序。绵羊BOLL在不同哺乳物种间(特别是山羊、川南山地黄牛和牦牛)具有高度的序列同源性和进化保守性。BOLL蛋白与10个雄性生殖细胞发育相关蛋白质分子间存在潜在的相互作用。随着年龄的增加,在藏绵羊睾丸中BOLL mRNA的表达持续上调,而其蛋白的表达先上调后下调。BOLL蛋白主要存在于性成熟后(1岁龄和3岁龄)睾丸内的精子细胞中,也在精母细胞和整个发育阶段的精原细胞中有少量分布。qRT-PCR结果显示,与3月龄相比,在1岁龄和3岁龄睾丸中微小RNAs(microRNAs,miRNAs)oar-miR-127-5p、oar-miR-382-5p和oar-miR-760-3p的表达量极显著下调(P0.01),而长链非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)LOC105602204、LOC105603195和LOC105616228以及环状RNAs(circular RNAs,circRNAs)circ-ECT2L和circ-SPHKAP的表达量极显著上调(P0.01)。oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p明显降低了BOLL 3′UTR野生型的荧光素酶活性,并且oar-miR-760-3p明显降低了野生型Circ-ECT2L和野生型LOC105616228报告基因的荧光素酶活性。【结论】报道了藏绵羊睾丸中BOLL的分子结构特征、表达规律及潜在的表达调控作用。BOLL主要在藏绵羊减数分裂后的圆形和长形精子细胞中表达,并且其表达受到oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p的直接靶向负调控以及oar-miR-760-3p介导的circRNA Circ-ECT2L和lncRNA LOC105616228的正向调控,进而可能与下游信号分子相互作用,以参与调节绵羊精子细胞向成熟精子分化。 相似文献
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【背景】雌激素是雌性哺乳动物卵巢组织分泌的主要激素,其对肌肉的生长发育起着重要的调控作用,circRNA已被发现参与多种与肌肉生长发育相关的信号通路。【目的】根据团队前期卵巢摘除苏尼特羊与假手术苏尼特羊全转录组整合分析发现circZNF423可作为内源性竞争RNA(ceRNA)调控oar-miR-541-3p/CALM3的表达。为进一步探究雌激素在绵羊肌肉生长中分子机制,通过体外培养绵羊原代成肌细胞,检测成肌细胞中外源添加雌激素介导circZNF423调控oar-miR-541-3p/CALM3对成肌细胞增殖的影响,为进一步研究雌激素及circRNA在绵羊生长发育性状中的作用机制提供理论依据,为绵羊分子设计育种提供新的研究思路。【方法】采集绵羊背最长肌组织,对绵羊原代成肌细胞进行体外分离培养,通过免疫荧光染色、RNA原位杂交（FISH）和核质分离试验确定circZNF423在成肌细胞中的表达位置;RNAhybrid在线软件预测circZNF423、oar-miR-541-3p和CALM3存在结合关系,通过双荧光素酶活性检测和生物素标记的miRNA下拉试验验证circZNF423和oar... 相似文献
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【目的】克隆分析绵羊联会复合中心组分蛋白1（synaptonemal complex central element protein 1,SYCE1）基因,检测其在雄性生殖轴系中的表达,探索SYCE1对雄性动物生殖发育的调控机制。【方法】以雄性绵羊（小尾寒羊）为研究对象,通过RT-PCR技术克隆SYCE1基因序列,并对该序列及其编码的蛋白进行生物信息学分析;利用qRT-PCR、Western blotting技术分析SYCE1在绵羊下丘脑-垂体-睾丸生殖轴及不同发育阶段（40日龄、3月龄和12月龄）睾丸中的表达情况;采用免疫组织化学染色方法检测SYCE1蛋白在不同发育阶段睾丸组织中的分布情况。【结果】核苷酸序列分析表明,SYCE1基因CDS全长972 bp,编码274个氨基酸。进化树结果表明,绵羊SYCE1氨基酸序列与山羊、欧洲普通牛、野牛、白尾鹿等的氨基酸同源性高;不同物种之间同源性分析发现,SYCE1基因在进化中高度保守;qRT-PCR、Western blotting检测结果表明,SYCE1 mRNA及其蛋白在绵羊的下丘脑、垂体、睾丸及附睾组织中均有表达,其中睾丸组织表达量极显著高于其他组织（P<0.01）,对于不同发育阶段的睾丸组织SYCE1表达水平随着绵羊年龄的增加逐渐升高;免疫组织化学染色结果显示,SYCE1蛋白在40日龄定位于睾丸间质细胞和少量精原细胞,在3月龄定位于睾丸初级精母细胞、精原细胞和间质细胞,在12月龄定位于睾丸初级精母细胞、次级精母细胞、精原细胞、间质细胞和支持细胞。【结论】SYCE1在雄性绵羊生殖轴和不同发育阶段睾丸中均有表达,随着绵羊年龄的增加SYCE1在睾丸组织中的表达水平逐渐上调,说明其与绵羊睾丸器官发育成熟度相关,推断其参与雄性绵羊生殖轴调控。 相似文献
4.
【目的】全面了解绵羊卵巢组织miRNAs表达情况,分析产单羔和产双羔绵羊卵巢miRNAs表达差异,从而为探讨miRNAs在繁殖力调控中的作用提供依据。【方法】应用多物种miRNA芯片对绵羊卵巢组织miRNA进行表达分析。首先选择经产单羔羊和双羔羊,发情后采集双侧卵巢提取总RNA,分离小片段 RNA与miRNA芯片杂交,然后进行数据分析获得绵羊卵巢组织miRNAs表达谱;利用生物信息学软件,以q-value ≤ 5%,且Fold Change ≥2 或≤0.5的标准筛选单羔羊和双羔羊卵巢差异表达miRNAs,并利用q-PCR技术验证芯片结果;分别采用microT和miRDB两种方法预测差异表达miRNAs的靶基因,然后合并两种方法结果数据取二者的交集,用在线软件对靶基因进行GO功能注释。【结果】在检测的来自所有物种的miRNAs中,有5 448个miRNAs在单羔和双羔羊卵巢组织中共同表达,22个在单羔羊卵巢中特异性表达,15个在双羔羊卵巢中特异性表达;对绵羊中已报道的103个miRNAs,比较其在两组母羊卵巢组织中的表达变化,共获得11个差异表达miRNAs,其中4个上调表达,7个下调表达;随机选择一个上调和一个下调表达的miRNAs进行q-PCR验证,定量结果与芯片结果一致,说明芯片结果准确、可信;预测获得7个miRNAs的靶基因,分别是：oar-miR-370-5p、oar-miR-376b-5p、oar-miR-381-5p、oar-miR-412-5p、oar-miR-541-3p、oar-miR-544-5p和oar-miR-1185-5p,每个miRNA获得的靶基因个数分别为：115、71、1、5、8、135和23个。GO注释结果显示,miR-376b-5p和miR-1185-5p的靶基因主要参与形成细胞内组分和细胞器,在分子功能分类中,绝大部分基因为连接分子类和催化活性分子类,在生物学过程分类中,主要参与细胞增殖、分化、凋亡过程和代谢过程;同时miR-376b-5p的靶基因IGF-1、DAZL、MTOR、MET、NEDD4和miR-376b-5p的靶基因AHR参与生殖过程的调控。【结论】成功构建了绵羊卵巢miRNAs表达谱,获得产单羔母羊和产双羔母羊卵巢组织差异表达miRNAs,这些miRNAs可能与绵羊卵泡发育和产羔数多少有关。 相似文献
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【目的】BCL2L11在哺乳动物中能够促进多种细胞凋亡,同时参与繁殖性状相关组织器官的发育及疾病治疗,文章利用分子生物学方法探究miR-221-3p靶向调控BCL2L11对小尾寒羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响,为进一步研究BCL2L11在卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁过程中的调控作用提供依据。【方法】在前期课题组卵巢组织全转录组测序分析的基础上,获得了候选基因BCL2L11及其调控元件miR-221-3p,利用半定量和组织荧光定量（RT-qPCR）分析BCL2L11在小尾寒羊不同组织中的表达情况;通过RT-qPCR定量试验在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中鉴定了BCL2L11及miRNA-221-3p的表达情况;构建BCL2L11 3’UTR野生型和突变型载体,在HEK293T细胞中共转染miR-221-3p mimic和BCL2L11野生型和突变型及阴性对照,采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-221-3p与BCL2L11靶向性关系;在绵羊卵巢原代颗粒细胞中转染miR-221-3p mimic及阴性对照实现miR-221-3p过表达,使用RT-qPCR技术在mRNA水平上检测miR-221-3p对BCL2L11以及卵巢颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas表达水平的影响;同时利用EdU试验分析miR-221-3p过表达和阴性对照组中颗粒细胞的增殖变化。【结果】半定量和组织RT-qPCR分析均表明BCL2L11在卵巢组织中表达量高于其他组织;RT-qPCR定量结果显示miR-221-3p和 BCL2L11在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中差异表达,miR-221-3p在卵泡期卵巢中的表达量高于黄体期,而BCL2L11在卵泡期卵巢中的表达量低于黄体期,表现出负调控的现象;双荧光素酶报告基因验证分析显示,过表达miR-221-3p mimic显著抑制了BCL2L11 3’UTR荧光素酶的活性（P<0.05）,阴性对照组则没有显著影响;过表达miR-221-3p,靶基因BCL2L11 mRNA表达水平显著降低,同时,卵泡颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas的表达量也显著降低（P<0.05）;EdU试验分析显示,过表达miR-221-3p的颗粒细胞增殖率为18.9%,极显著高于阴性对照组的10.43%（P<0.01）。【结论】BCL2L11和miR-221-3p是调控绵羊卵巢发育的重要基因及调控元件,BCL2L11是miR-221-3p的靶基因之一,miR-221-3p过表达可抑制颗粒细胞凋亡,该作用结果可能通过抑制靶基因BCL2L11的表达进而影响了绵羊卵巢颗粒细胞的凋亡。 相似文献
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褐飞虱一个新的海藻糖合成酶基因的特性、 发育表达及RNAi效果分析 总被引：1，自引：1，他引：0
背景 昆虫海藻糖合成酶基因是昆虫海藻糖合成的主要基因,大多数昆虫中只拥有一个海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase,TPS）基因,部分昆虫存在一个海藻糖-6-磷酸酯酶（trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP）基因。前期研究发现褐飞虱（Nilaparvata lugens）中拥有两个TPS,对其功能研究发现TPS不仅能够调控海藻糖代谢,还可介导海藻糖酶调控几丁质合成与降解途径,控制昆虫的蜕皮过程。目的 通过对褐飞虱转录组测序分析获得了一个新的TPS,检测该基因在褐飞虱不同发育阶段的表达情况,探究该基因的功能与前期发现的两个TPS的区别。方法 对获得的新TPS基因序列采用克隆技术获得全长cDNA序列,经验证正确后,对其蛋白的一级、二级、三级结构及与其他昆虫的TPS进行比对分析,最后采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术测定3个不同TPS在褐飞虱不同发育阶段的表达,并采用RNA干扰（RNAi）技术抑制TPS3的表达。结果 在前期研究的基础上,克隆出一个新的TPS,并命名为TPS3。TPS3开放阅读框长度为2 352 bp,编码783个氨基酸,预测蛋白分子量为88.9 kD,等电点为5.47,具有亲水性结构。生物信息学分析表明,褐飞虱3个TPS蛋白具有较高的同源性,都具有TPS和TPP两个保守结构域及其他特征序列,并且α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲所占的比例较为接近。褐飞虱不同发育阶段3条TPS的相对表达量不同,TPS1的相对表达量从4龄0 h开始逐渐上升,至成虫阶段达到最高,TPS2的相对表达量从4龄末期开始明显上升且在整个5龄阶段都有较高的表达,TPS3的相对表达量在5龄末期和成虫初期较高。单独干扰褐飞虱TPS3 48 h后被干扰基因的相对表达量下降,dsTPS3能有效抑制TPS3的表达。结论 在褐飞虱中发现一个新的TPS（TPS3）,其与褐飞虱中已经报道的TPS1和TPS2具有较高的同源性。不同发育阶段表达结果表明,3个TPS在发育过程中行使的功能不同。RNAi能够有效抑制TPS3的表达并导致褐飞虱蜕皮障碍和翅发育畸形。 相似文献
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旨在研究KDM2A在牦牛睾丸发育和精子发生中的作用,为提高牦牛繁殖性能提供理论依据。提取牦牛胎儿时期(5～6月龄)、幼年时期(1～2岁)、性成熟时期(3～4岁)睾丸的总RNA,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测KDM2A在牦牛睾丸中的表达情况。结果显示:3个时期牦牛睾丸中均有KDM2A基因表达,且表达量随年龄增长呈递增趋势,性成熟时期睾丸中KDM2A mRNA与蛋白质的表达量均显著高于胎儿时期和幼年时期;胎儿时期仅在精原干细胞及支持细胞中表达,幼年和性成熟时期睾丸中精原细胞、支持细胞、初级精母细胞、圆形精子及精子形成期均呈阳性。表明KDM2A在牦牛不同发育阶段的睾丸中表达,在牦牛睾丸发育及精子生成中发挥重要作用。 相似文献
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为研究绵羊脂肪细胞增殖分化过程中参与动物能量代谢调控的大麻素受体1（cannabinoid receptor 1）基因CNR1和调控脂肪沉积的脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4）基因FABP4的表达规律和差异,采集一只3日龄湖羊羔羊背最长肌组织,背肌组织经Ⅱ型胶原酶消化后分离观察原代前体脂肪细胞;开展前体脂肪细胞培养并绘制生长曲线;应用胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤诱导前体脂肪细胞后,采用油红O染色观察成熟脂肪细胞形态;收集不同分化时间点细胞,应用实时荧光定量PCR方法测定CNR1和FABP4基因表达量。结果表明,羔羊背最长肌组织成功分离出了前体脂肪细胞,贴壁细胞呈梭形;诱导前体脂肪细胞经油红O染色后观察到脂滴形成,具有脂肪细胞特征;CNR1和FABP4基因表达量在诱导分化早期均较低,但在诱导分化中后期表达量逐步升高;CNR1和FABP4基因表达量在诱导分化后的第2、第4和第8天均差异不显著,但FABP4基因在第12天的表达量显著高于CNR1基因。上述结果为进一步探究绵羊CNR1和FABP4基因调控关系及利用两基因改良绵羊肉品性状提供了参考数据。 相似文献
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藏绵羊不同毛色皮肤组织miRNA表达谱及靶基因分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】藏绵羊又称藏系绵羊,是中国三大粗毛羊品种之一,主要分布在西藏及其毗邻的高寒牧区,如青海、甘肃、四川、云南等地。藏绵羊由于其被毛纤维粗长,毛质细腻且保暖性好,是制造藏式地毯的上好原料。而毛色作为一种重要的经济性状,同时制约羊毛的经济价值。然而,目前对于绵羊毛色的分子调控机制尚不明确,以藏绵羊为研究对象,对其不同颜色皮肤组织（黑色和白色）进行转录组测序,旨在探讨miRNA在藏绵羊不同毛色皮肤组织转录后水平中发挥的作用及其可能参与的调控通路。【方法】选取2只具有黑白花毛色的健康藏绵羊,减去体侧被毛使皮肤完全裸露并用75%酒精消毒处理,屠宰后快速切取皮肤组织并保存在组织样品保存液中防止RNA降解,提取RNA后通过miRNA测序和生物信息学分析,获得藏绵羊不同毛色（黑色和白色）皮肤组织miRNA表达谱,筛选组织差异表达miRNA并预测相关靶基因。通过靶基因分析,获得与调控藏绵羊毛色性状可能相关的信号通路。【结果】黑色和白色皮肤组织共获得85.76兆条原始读长,经过滤后得到85.08兆条clean reads;共鉴定出334个已知的miRNA和59个新的miRNA;从中获得23个差异表达miRNA,其中14个差异表达miRNA在白色皮肤组织中表达显著上调,9个表达下调。miR-2284b和miR-744仅在藏绵羊白色皮肤中表达,而miR-23b、miR-411a-5p、miR-30c、miR-423-3p和miR-324-5p则仅在藏绵羊黑色皮肤中表达,但表达量相对较低。表达量最高的miRNA为miR-10a,而倍数差异最大的为miR-23b。其中,miR-10a可参与调节多种信号通路,其作用涉及增殖、分化、凋亡、细胞粘附等各个方面,目前并无调控绵羊毛色方面的相关报道,但其功能及作用机制的研究仍在不断扩展。miR-23b则与Wnt、Notch等信号通路有关,这些信号通路中的部分基因也和黑色素的生成有密切关系。结合倍数差异和miRNA表达量分析,miR-411a-5p、miR103和miR-200b可能也和毛色调控密切相关。本研究共预测出981个靶基因可能参与毛色调控,多数基因和WNT信号通路、MAPK通路、EDNRB信号通路及黑素原生成通路（melanogenesis pathway）相关,其中黑素原生成通路显示和WNT信号通路、KIT信号通路及EDNRB信号通路相互关联。黑素原生成通路显示藏绵羊不同毛色可能最终通过MITF基因调控下游的TYR基因（酪氨酸酶基因）影响黑色素的合成。同时,筛选7个差异表达miRNA进行定量验证,结果表明,5个miRNA在黑色皮肤组织中上调表达,2个miRNA在白色组织中上调表达,定量结果与测序结果一致。【结论】获得了藏绵羊皮肤组织miRNA表达谱,并通过生物信息学分析得到可能和调控毛色性状相关的miRNA和信号通路。这些结果表明,藏绵羊毛色性状可能受到多种miRNA的调控并涉及多个信号通路,这有助于更进一步了解毛色转录后水平的调控过程,并对进一步的功能验证奠定基础。 相似文献
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【目的】研究内皮性一氧化氮合酶(endothelial NOS,eNOS)在高原地区成年藏绵羊和小尾寒羊睾丸组织中的定位及分布特征.【方法】采用免疫组化SP法结合半定量法描述染色结果分布密度,蛋白免疫印迹(Western blot,WB)分析比较.【结果】eNOS免疫组织化学分布密度表明,小尾寒羊睾丸精子细胞和精原细胞强阳性表达,而在藏绵羊精子和精原细胞内无明显表达;小尾寒羊间质细胞(leydig cell)和支持细胞(sertoli cell)为中等阳性表达,在藏绵羊弱阳性表达.eNOS在藏绵羊及小尾寒羊小血管均为阳性表达.Western免疫印迹显示eNOS抗体有较好的反应性,且小尾寒羊睾丸组织蛋白反应性强于藏绵羊睾丸组织提取蛋白.【结论】高原环境中,eNOS可参与调节高原地区绵羊睾丸局部血管舒缩以适应环境温度变化;小尾寒羊生精上皮eNOS表达较强可能是高寒环境中精子生成过程中的低氧应激反应的一个方面. 相似文献
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【目的】研究LEF1、YWHAZ及WNT2基因表达量与毛色之间的关系,为分析LEF1、YWHAZ及WNT2基因在Wnt/β-actenin信号通路中的分子机制奠定基础。【方法】采用随机选取黑色和白色被毛的巴什拜羊各8只,采集皮肤组织,通过定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)方法测定LEF1、WNT2及YWHAZ基因在不同毛色巴什拜羊皮肤中的表达量,并与LEF1、YWHAZ及WNT2基因转录组测序结果的FPKM值进行双向验证。【结果】LEF1基因在黑色巴什拜羊皮肤组织相对表达量是(4.66±0.59),在白色巴什拜羊皮肤组织是 (0.43±0.15);WNT2基因在黑色巴什拜羊组织相对表达量是(7.35±0.77),在白色巴什拜羊皮肤组织是(0.36±0.11);YWHAZ基因在黑色巴什拜羊组织相对表达量是 (4.44±0.57),在白色巴什拜羊皮肤组织是(1.02±0.23)。LEF1、YWHAZ及WNT2基因的转录组数据的FPKM值与qRT-PCR结果趋势一致。【结论】LEF1、WNT2及YWHAZ基因在不同毛色的巴什拜羊皮肤组织中均有表达。且LEF1、WNT2及YWHAZ基因在黑色绵羊皮肤中的表达量极显著高于白色绵羊皮肤(P<0.01),LEF1、WNT2及YWHAZ参与毛色的形成过程,可作为绵羊毛色潜在基因研究与毛色之间的相关性。 相似文献
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【目的】预测并验证靶向猪内质网应激通路中关键基因的microRNAs（miRNAs）,为进一步研究miRNAs对猪内质网应激信号通路调控提供理论基础。【方法】首先利用伪狂犬病毒（PRV）感染猪肾上皮（PK15）细胞,高通量测序检测差异表达的miRNAs。然后通过TargetScan预测靶向内质网应激通路关键基因ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1的miRNAs。构建含有候选miRNAs作用位点的双荧光素酶报告基因重组载体,并分别与miRNA-mimics共转染幼仓鼠肾（BHK-21）细胞,通过测定荧光素酶活性来验证内质网应激通路关键基因与候选miRNAs的靶标关系。然后在PK15细胞中分别过表达候选miRNAs,利用qRT-PCR和Western blot检测候选miRNAs对内质网应激通路关键基因mRNA和蛋白表达的影响。【结果】miRNA测序结果显示,PRV感染后共引起35条miRNAs差异表达。TargetScan预测显示,靶向ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1的交集miRNAs为miR-142-5p、miR-145-5p、miR-150和miR-199a-5p,并将这些交集miRNAs作为候选miRNAs。随后成功构建psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m145-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m150-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m199-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1- m150-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR、psiCHECK-2-PERK-m145/150-3′UTR、psiCHECK- 2-XBP1-m142/ 145/150/199-3′UTR、psiCHECK-2-GRP78-m145/199-3′UTR双荧光素酶报告基因载体。双荧光素酶检测结果显示,miR-142-5p显著抑制psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR荧光素酶活性。psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR分别与miR-142-5p mimics、miR-145-5p mimics、miR-199a-5p mimics共转染,以及psiCHECK-2-XBP1-m142/145/ 150/199-3′UTR分别与miR-142-5p mimics、miR-199a-5p mimics共转染,过表达组的荧光素酶活性均极显著低于阴性对照组。同时miR-145-5p能够显著抑制psiCHECK-2-PERK-m145/ 150-3′UTR荧光素酶活性。这些结果表明miR-142-5p、miR-145-5p和miR-199a-5p均有可能分别靶向ATF6、IRE1、XBP1,而其中miR-142-5p可能同时靶向这三个关键基因调控内质网信号通路。通过qRT- PCR和Western blot分析发现,过表达miR-142-5p后显著抑制ATF6的mRNA和蛋白表达,表明miR- 142-5p靶向ATF6参与调控内质网应激信号通路。【结论】验证了靶向内质网应激通路关键基因ATF6的miRNA- miR-142-5p,为进一步研究miR-142-5p通过调控ATF6的表达而影响内质网应激信号通路奠定了基础。 相似文献
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【目的】检测WNT2基因在苏博美利奴羊胚胎期135 d不同组织中的表达水平,了解WNT2基因的分子结构和进化特征,从分子水平及进化特征上研究苏博美利奴羊的组织器官与WNT2基因表达之间的内在联系,为筛选细毛羊毛囊发育相关候选基因提供理论依据。【方法】采用qRT-PCR法研究苏博美利奴羊毛囊成熟时期WNT2基因在不同组织中的表达,并使用PROMO软件预测WNT2基因启动子区域序列的转录因子,并用Cytoscape_v3.5.1软件可视化,使用MEGA 7.0软件分析WNT2基因启动子区域序列的核苷酸组成成分及密码子的偏好性,并且利用绵羊、山羊、牛、人等9个物种的WNT2基因的DNA序列构建系统进化树。【结果】WNT2基因在皮肤组织中的表达量极显著高于心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织。在绵羊WNT2基因启动子区域序列共预测出101个相关转录因子,4种碱基呈现均匀分布,CAG与UCU是使用相对较多的密码子,对WNT2基因的DNA序列系统进化树分析发现山羊和绵羊之间的进化关系比与其他哺乳动物进行比较时更为接近。【结论】建立了胚胎期135 d的苏博美利奴羊的不同组织中WNT2基因表达量的RT-PCR方法,并使用生物信息学软件对其分子结构和进化特征进行分析。 相似文献
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【目的】分析LEF1基因在红棕色与青灰色巴什拜羊皮肤组织中DNA甲基化与mRNA的表达水平。【方法】运用BSP(亚硫酸盐修饰后测序PCR)与RT-RCR(实时荧光定量PCR),检测不同毛色巴什拜羊皮肤组织LEF1基因启动子区的甲基化水平与mRNA表达量。【结果】在红棕色巴什拜羊皮肤组织中的LEF1基因启动子区的甲基化水平高于青灰色的甲基化水平,且二者甲基化CpG位点不同,二者呈显著的负相关(P< 0.05)。【结论】DNA甲基化水平对红棕色与青灰色巴什拜羊的毛色形成具有调节作用,可作为一个候选的巴什拜羊毛色遗传标记。 相似文献
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【目的】 为了丰富和加深人们对植物叶色形成的分子机理认识,对水稻黄绿叶突变体ygl3（yellow green leaf 3）进行表型鉴定和基因克隆,阐明YGL3的分子功能,为解析YGL3调控水稻叶色形成的分子机理奠定基础。【方法】 从水稻中花11 CRISPR-Cas9敲除突变体库中鉴定出2份稳定遗传的等位黄绿叶突变体,命名为ygl3-1与ygl3-2,对突变体的表型进行鉴定,测定野生型和突变体苗期的叶绿素含量,运用透射电镜观察野生型和突变体ygl3的叶绿体结构。利用实时荧光定量PCR分析YGL3的组织表达模式,并使用BioXM 2.6软件对YGL3及其同源蛋白序列进行比对,采用酵母双杂交方法筛选YGL3的互作蛋白。【结果】 在苗期,与野生型相比,突变体ygl3叶片黄化,叶绿素、类胡萝卜素和总光合色素含量显著降低。透射电镜结果表明,突变体ygl3叶绿体形态异常,类囊体片层结构较少,而野生型叶绿体形态正常,类囊体片层结构排列有序。CRISPR-Cas9敲除位点鉴定结果表明,LOC_Os01g73450发生单碱基插入,导致蛋白翻译提前终止,该基因编码351个氨基酸的蛋白突变为55个氨基酸的截短蛋白。与野生型相比,LOC_Os01g73450的表达水平在突变体中显著下调。qRT-PCR结果表明YGL3在水稻根、穗、种子、叶鞘以及叶片中均有表达,且叶片中表达水平最高。YGL3编码一个质体定位的尿嘧啶核苷酸激酶。蛋白氨基酸序列比对表明YGL3蛋白在玉米、高粱、拟南芥等物种中均较为保守,与拟南芥同源蛋白氨基酸的同源性为59.4%。qRT-PCR结果表明,叶绿素合成基因（如HEMC、HEME和URO-D）在突变体ygl3中显著下调,而HEMB、HEMF和HEML等叶绿素合成基因在野生型与突变体之间无显著差异。酵母双杂交系统筛选水稻叶片酵母cDNA文库,发现YGL3与RNA编辑因子MORF8存在互作。【结论】 水稻黄绿叶突变体ygl3的表型是由LOC_Os01g73450突变导致,该基因与已报道的水稻黄绿叶基因YL2/YGL8等位。YGL3在叶片中高度表达,同时YGL3与MORF8在酵母中互作。 相似文献
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绵羊SMAD1基因组织表达及其多态性与产羔数关联分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】绵羊产羔数是一个极其复杂的性状,受诸多因素影响。绵羊排卵数是最重要的因素之一,而SMAD蛋白在哺乳动物卵泡发育和颗粒细胞生长分化过程中发挥着重要作用。因此本文基于前期绵羊基因组重测序数据,深入研究SMAD家族成员1 (SMAD family member 1, SMAD1)基因在不同繁殖力小尾寒羊组织表达模式,并探讨其多态性与绵羊产羔数的关系,以揭示其影响产羔数的机制,为绵羊分子育种提供科学依据。【方法】首先,采用反转录PCR技术检测SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊群体大脑,小脑,下丘脑,垂体,子宫,卵巢,输卵管,心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,肾上腺,甲状腺,大肠,小肠,胰腺,瘤胃,肾脂 19种组织的表达模式,然后利用实时荧光定量PCR技术检测SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊下丘脑,垂体,子宫,卵巢,输卵管5种繁殖组织的相对表达量。随后采用Sequenom MassARRAY ?SNP技术对SMAD1基因5个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点在小尾寒羊（n=380）、湖羊（n=101）、苏尼特羊（n=21）、草原型藏羊（n=161）、策勒黑羊（n=52）、滩羊（n=22）6个绵羊品种中进行基因型检测,计算其群体遗传学指标,利用SPSS19.0软件分析5个SNPs与小尾寒羊产羔数的相关性。【结果】PCR结果显示,SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊全身性组织均有表达,在小尾寒羊单羔群体卵巢的表达量极显著高于多羔群体（P<0.01）,小尾寒羊单羔群体下丘脑、垂体的表达量显著高于多羔群体（P<0.05）;基因分型结果表明,g.12485895A>G,g.12487558G>A和g.12487190G>T位点在单、多羔绵羊品种中基因型和等位基因频率均差异显著（P<0.05）;而g.12508874T>C和g.12487467A>G位点在单、多羔绵羊品种中基因型和等位基因频率均差异不显著（P>0.05）;群体遗传学分析表明,g.12485895A>G、g.12487558G>A、g.12508874T>C、g.12487467A>G、g.12487190G>T位点在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、苏尼特羊、草原型藏羊中均为中度多态（0.25<PIC<0.5）,g.12508874T>C位点在滩羊群体表现为低度多态（PIC<0.25）;卡方适合性检验表明,g.12485895A>G和g.12487467A>G位点在小尾寒羊和草原型藏羊中处在Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05）,g.12487558G>A在小尾寒羊和湖羊群体处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05）,g.12487190G>T位点在草原型藏羊处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05）。其他位点在6个绵羊品种中均处在Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）;关联分析表明,g.12485895A>G,g.12487558G>A,g.12508874T>C和g.12487467A>G位点与小尾寒羊产羔数无显著关联。g.12487190G>T位点TT基因型母羊前三胎的产羔数均显著高于GT和GG基因型母羊（P<0.05）。将该位点与小尾寒羊FecB（A746G）不同基因型进行组合后发现,AA-GG、AA-GT、AA-TT型母羊产羔数显著低于其他组合基因型母羊（P<0.05）。【结论】SMAD1与小尾寒羊繁殖密切相关,g.12487190G>T可作为小尾寒羊产羔性状选育的潜在分子标记。 相似文献
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【目的】 研究小麦ZY96-3籽粒在灌浆过程中与籽粒发育相关基因的表达模式,为了解基因调控籽粒灌浆的分子机制提供参考。【方法】 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,分析小麦ZY96-3籽粒灌浆期间6个与籽粒发育相关基因的表达动态。【结果】 从小麦ZY96-3开花后6个目标基因的表达模式均是先增后降,且都在花后7 d开始表达;与粒重相关基因TaTGW6在花后7 d表达量最高,与籽粒大小相关基因TaCYP78A5、蛋白质合成基因TaPBF-D和淀粉合成酶基因GBSSⅠ、SBE1、AGPase1都在花后15 d左右表达量达到最大;自花后19 d开始,各基因的表达量均显著下降。【结论】 与粒重相关基因TaTGW6主要在小麦ZY96-3籽粒灌浆初期起关键作用,而其余5个基因主要在籽粒灌浆中后期发挥功能。基因在小麦ZY96-3籽粒灌浆期间的表达模式。 相似文献