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褐飞虱一个新的海藻糖合成酶基因的特性、 发育表达及RNAi效果分析 总被引：1，自引：1，他引：0
背景 昆虫海藻糖合成酶基因是昆虫海藻糖合成的主要基因,大多数昆虫中只拥有一个海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase,TPS）基因,部分昆虫存在一个海藻糖-6-磷酸酯酶（trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP）基因。前期研究发现褐飞虱（Nilaparvata lugens）中拥有两个TPS,对其功能研究发现TPS不仅能够调控海藻糖代谢,还可介导海藻糖酶调控几丁质合成与降解途径,控制昆虫的蜕皮过程。目的 通过对褐飞虱转录组测序分析获得了一个新的TPS,检测该基因在褐飞虱不同发育阶段的表达情况,探究该基因的功能与前期发现的两个TPS的区别。方法 对获得的新TPS基因序列采用克隆技术获得全长cDNA序列,经验证正确后,对其蛋白的一级、二级、三级结构及与其他昆虫的TPS进行比对分析,最后采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术测定3个不同TPS在褐飞虱不同发育阶段的表达,并采用RNA干扰（RNAi）技术抑制TPS3的表达。结果 在前期研究的基础上,克隆出一个新的TPS,并命名为TPS3。TPS3开放阅读框长度为2 352 bp,编码783个氨基酸,预测蛋白分子量为88.9 kD,等电点为5.47,具有亲水性结构。生物信息学分析表明,褐飞虱3个TPS蛋白具有较高的同源性,都具有TPS和TPP两个保守结构域及其他特征序列,并且α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲所占的比例较为接近。褐飞虱不同发育阶段3条TPS的相对表达量不同,TPS1的相对表达量从4龄0 h开始逐渐上升,至成虫阶段达到最高,TPS2的相对表达量从4龄末期开始明显上升且在整个5龄阶段都有较高的表达,TPS3的相对表达量在5龄末期和成虫初期较高。单独干扰褐飞虱TPS3 48 h后被干扰基因的相对表达量下降,dsTPS3能有效抑制TPS3的表达。结论 在褐飞虱中发现一个新的TPS（TPS3）,其与褐飞虱中已经报道的TPS1和TPS2具有较高的同源性。不同发育阶段表达结果表明,3个TPS在发育过程中行使的功能不同。RNAi能够有效抑制TPS3的表达并导致褐飞虱蜕皮障碍和翅发育畸形。 相似文献
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褐飞虱海藻糖酶基因在表皮几丁质代谢中的调控作用 总被引：4，自引：4，他引：0
【目的】昆虫海藻糖酶能够调控几丁质代谢并控制蜕皮过程。本研究通过TRE表达被抑制后,检测褐飞虱(Nilaparvata lugens)蜕皮状况、几丁质含量及几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)和几丁质酶(chitinase,Cht)基因表达情况,探究不同的海藻糖酶(trehalase,TRE)在褐飞虱表皮中对几丁质代谢的调控作用。【方法】采用RNAi技术,以实验室饲养种群褐飞虱为材料,通过向其体内注射双链RNA(dsRNA)分别抑制单个海藻糖酶基因或同时抑制多个海藻糖酶基因,注射48 h后通过Trizol法提取褐飞虱总RNA,反转录试剂盒合成第一链DNA后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测该基因的表达情况,确定RNAi效果。氢氧化钾法测定48 h褐飞虱整体几丁质含量变化并对蜕皮困难虫体进行拍照;最后采用qRT-PCR检测褐飞虱CHS和Cht在mRNA水平上的相对表达量变化,分析TRE在调控几丁质代谢中的作用。【结果】与注射dsGFP相比较,其余各注射组褐飞虱整体几丁质含量显著下降,其中dsTRE1混合注射组与Validamycin注射组呈极显著下降,同时褐飞虱出现蜕皮困难等现象。qRT-PCR检测结果显示单个TRE的dsRNA注射后该基因的表达被抑制,但是部分TRE的表达有互补性上升。其中TRE1-2和TRE2在各注射组处理下表达均下降,dsTRE1s对TRE2的表达也有抑制效果,整体上dsTRE1混合注射组和海藻糖酶抑制剂Validamycin抑制效果明显;dsTRE注射组抑制CHS表达效果不明显,Validamycin能够显著降低CHS1和CHS1a在表皮中的表达,且2种dsTRE1注射后CHS1表达在上升,dsTRE1-2注射后表皮中的CHS1a的表达上升;Cht1和Cht8在dsTRE各注射组及Validamycin处理中表达下降或显著下降,dsTRE1-1注射后Cht2和Cht5表达显著上升;dsTRE1-2注射后Cht1、Cht6和Cht8表达下降,Cht2和Cht4表达显著上升;dsTRE2处理组中Cht1、Cht8和Cht10表达下降而Cht9表达显著上升;dsTRE1s注射后,Cht1和Cht5表达显著下降,而Cht9表达显著上升;Validamycin注射组中10个几丁质酶基因表达都显著或者极显著下降。【结论】TRE能够通过调控褐飞虱几丁质代谢途径来控制几丁质的合成,结果可为开展和筛选有效的海藻糖酶抑制剂控制褐飞虱等害虫提供理论依据。 相似文献
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为明确不同水稻品种与褐飞虱的相互作用关系,以水稻品种TN1(感虫品种)、中浙优1号(生产主栽品种)和IR56(抗虫品种)为研究对象,分别采用蒽酮法和葡萄糖分析试剂测定了褐飞虱取食不同水稻品种后对褐飞虱和稻株体内的海藻糖含量及海藻糖酶活性的影响。结果显示,被褐飞虱取食后,IR56和中浙优1号的海藻糖酶活性分别由无虫状态下的3.56、4.34 nmol·g~(-1)·min~(-1)显著升高至7.53、6.05 nmol·g~(-1)·min~(-1),海藻糖含量分别由12.10、5.14 nmol/μg降至3.14、2.43 nmol/μg,而TN1的海藻糖酶活性由1.46 nmol/μg显著升高至3.05 nmol/μg,海藻糖含量无明显变化。取食TN1、IR56和中浙优1号后,褐飞虱体内的海藻糖含量分别为0.53、0.28和0.20nmol/μg,取食后二者的褐飞虱体内海藻糖含量与TN1组相比较均显著降低;且褐飞虱体内海藻糖酶活性以及3个海藻糖酶基因在mRNA水平均显著低于TN1组。表明海藻糖及海藻糖酶在褐飞虱与抗虫水稻的相互作用中可能发挥着重要的调控作用。 相似文献
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异色瓢虫低温胁迫下过冷却点变化及抗寒基因表达分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】异色瓢虫(Harmonia axyridis)是一种重要的捕食性天敌昆虫资源,在东北地区以成虫越冬,具有非常强的抗寒能力。以过冷却点和抗寒基因的mRNA水平变化作为瓢虫抗寒性能指标,探索低温胁迫提高瓢虫抗寒的作用。【方法】将野外采集到的异色瓢虫通过0、5和10℃ 3种不同温度,进行2、12和24 h 3种时间的低温胁迫处理,测定过冷却点的变化,得到最佳低温胁迫条件。以室内饲养的异色瓢虫作为对照组,分别在5℃低温条件下储存10、20和30 d,测定过冷却点变化和存活情况。根据转录组和数字表达谱（digital gene expression,DGE）数据分析确定6个重要抗寒基因,选择18S作为内参基因,采用实时荧光定量PCR检测异色瓢虫6个重要抗寒基因在低温胁迫和保存时mRNA水平上的相对表达量,分析其在抗寒过程中所起的作用。【结果】5℃低温胁迫12 h能够显著降低异色瓢虫的过冷却点。在低温保存过程中,低温胁迫组异色瓢虫过冷却点和存活率低于未进行低温胁迫组。实时荧光定量PCR检测发现HSP21.4、trehalase、transketolase、ATP-grasp fold domain protein和dopa decarboxylase在低温胁迫过程中表达量上调,而erythrocyte binding protein的表达量下调。且在低温保存过程中HSP21.4一直处于高表达状态,显著高于未进行低温胁迫组,其余5个基因在低温保存过程中处于低表达状态,显著低于未进行低温胁迫组。【结论】低温胁迫能够降低异色瓢虫的过冷却点,但不一定能够提高夏季野外耐高温异色瓢虫的存活能力。HSP21.4和erythrocyte binding protein分别通过高表达和低表达来提高异色瓢虫的抗寒能力,而trehalase、transketolase、ATP-grasp fold domain protein和dopadecarboxylase通过在低温胁迫过程中高表达,保护异色瓢虫抵御寒冷环境。 相似文献
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