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1.
用纯化的重组HIS标签N蛋白免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSVN蛋白的单克隆抗体（McAb）,经细胞融合获得5株可分泌特异性McAb的抗PRRSVN蛋白的杂交瘤细胞1A12,3F11,5A3,5F9,4E4。其中1A12,3F11,5A3,4E4杂交瘤上清与HIS-蛋白与GST—N蛋白两种抗原包被的ELIA反应均为阳性。5F9与HIS—N蛋白包被的ELISA反应为阳性,而与GST—N蛋白包被的ELISA反应呈阴性。单抗1A12,3F11,4E4,5A3与HIS-N与GST—N蛋白的Western blotting反应均为阳性,而5F9只与HIS-N反应。IFA检测显示1A12,3F11,5A3,4E4株单抗都有明显的荧光,说明其与PRRSV呈阳性反应。同时,ELISA检测又有很好的特异性。 相似文献
2.
分别用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(McAb)。用纯化的PRRSV免疫小鼠,经细胞融合获得2株可分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为4B8、4D8。用重组N蛋白免疫的小鼠,经细胞融合获得3株可分泌特异性McAb的抗PRRSV N蛋白的杂交瘤细胞2F3、4D5、5D11。间接ELISA检测4D8、4B8、4D5和5D11杂交瘤上清效价为1∶32~1∶512,而2F3的腹水效价为1∶12 800。单抗2F3、4B8和4D8与纯化病毒的Western blotting反应都为阳性,而4D5和5D11为阴性。IFA检测结果5株单抗都有明显的荧光,与PRRSV呈阳性反应。2F3的Ig亚型为IgM。5株单抗杂交瘤细胞连续传代至20代,分泌相应McAb的效价基本一致。本研究为PRRSV生物学诊断和方法研究提供有用工具。 相似文献
3.
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的重要病原,为了解析该病毒N蛋白抗原表位,本研究制备获得纯化的重组N蛋白,经过BALB/c小鼠免疫、细胞融合、间接ELISA方法筛选和Western blot鉴定,获得了7株稳定分泌抗PRRSV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清液抗体效价为1∶800～1∶25 600,其中8F1、5E2、2B1、12E1的重链类型为IgG1,4F1、2H2、5A2的重链类型为IgG2b,轻链类型都为κ型。间接免疫荧光试验显示7株单克隆抗体均与PRRSV感染细胞产生反应,可识别3种不同的B细胞线性表位,分别位于47～57 aa、57～67 aa及67～77 aa区域,其中57～67 aa为新发现的抗原表位。本研究结果为PRRSV诊断试剂盒的开发和流行病学调查提供了有用工具。 相似文献
4.
《中国兽医杂志》2019,(1)
为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体,本实验以重组PEDV-N蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,经过3～5次亚克隆与筛选,获得了4株分泌抗PEDV McAb的杂交瘤细胞,分别命名为4A7、6C1、5E10和6F7。4株杂交瘤细胞分泌的McAb均为IgM,其轻链均为κ链。ELISA、Western Blot和免疫荧光鉴定结果表明,4株单抗均与N蛋白及PEDV具有良好的结合活性。复苏冻存的4株杂交瘤细胞,连续传代培养30代,4株杂交瘤细胞能够持续稳定分泌抗体,细胞上清的ELISA抗体效价均在1∶800以上。4株细胞诱生的小鼠腹水抗体效价为1∶10~5～1∶10~6。将单克隆抗体(4A7)用于免疫组化试验和IPMA时,其能够特异地识别PEDV人工感染猪小肠组织和Vero细胞内的病毒。上述实验结果表明,制备的单克隆抗体可以用于PEDV抗原检测以及体内病毒的组织定位分析,并可为进一步研发PEDV抗原或抗体检测技术奠定基础。 相似文献
5.
为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白单克隆抗体，将PRRSV类NADC30毒株FJ1402的M蛋白胞外区基因与TAT穿膜肽基因融合，密码子按大肠杆菌偏嗜性优化，构建了大肠杆菌表达质粒，制备获得重组M蛋白。取6周龄雌性BALB/c小鼠免疫重组蛋白，将脾脏淋巴细胞和SP2/0细胞融合，用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，获得4株分泌M蛋白抗体的杂交瘤细胞株。其中1E7、2F7、3A12的细胞上清液抗体效价为1∶3 200,3G7的细胞上清液抗体效价为1∶800,传至第15代均能稳定分泌抗体。单抗经亚型鉴定可知1E7、2F7、3A12的重链类型为Ig2a, 3G7的重链类型为IgG1,轻链类型都为κ型。经间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot鉴定，4株单克隆抗体均可与PRRSV产生特异性反应，鉴定出2个抗原表位，为PRRSV诊断和疫苗研制奠定了基础。 相似文献
6.
用含1%甲醛的磷酸盐缓冲液对相思子毒素-a(abrin-a)减毒处理制备类毒素,以类毒素为免疫抗原分4次免疫3只BALB/c小鼠。采用聚乙二醇(PEG)法,取免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选分泌抗abrin-a的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株。将阳性细胞株接种BALB/c小鼠制备McAb腹水,根据亚类鉴定结果,分别采用蛋白A或蛋白G亲和层析柱纯化腹水,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测McAb特异性,Western-blot法分析McAb抗原识别位点。结果获得1G5、3C2和4G1共3株McAb杂交瘤细胞株,均为抗abrin-a的特异性McAb,与相思子凝集素、蓖麻毒素(ricin)和蓖麻凝集素均无交叉反应,其中4G1为特异性结合abrin-a A链的McAb,1G5和3C2两株为特异性结合abrin-a B链的McAb;制备的McAb可用于abrin-a含量的检测。 相似文献
7.
应用B-淋巴细胞杂交瘤技术,建立了5株稳定分泌抗空肠弯曲菌共同抗原(CA)单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株(4A7,9D6、9C2、11A1、11D4)。在5株杂交瘤分泌的McAb中,有4株(4A7、9D6、11A1、11D4)针对CA中的耐热抗原成分,对其中4A7、9D6两株分泌的McAb进行免疫印迹分析表明,其与CA中大约为7.7×104u的蛋白移行带出现特异反应;一株(9C2)针对CA中的不耐热抗原成分。对杂交瘤细胞的核型分析表明,其染色体数在93-108之间。体外传代4个月,仍保持稳定分泌抗体的特性。这种McAb具有较强的特异性,除与幽门弯曲菌出现弱阳性反应外,与参试的其它31种非弯曲菌属的细菌均为阴性反应。对不同地区、不同来源的516株空肠弯曲菌的鉴定表明,制备的McAb与现有空肠弯曲菌均出现阳性反应,与常规鉴定法的符合率为100％。 相似文献
8.
猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备 总被引：1，自引：1，他引：0
试验通过RT-PCR法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)基因并克隆到原核表达载体pet-30a中,转入到BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,使用SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物的特性。利用Ni柱纯化该重组蛋白,采用NC膜皮下包埋法免疫Balb/C小鼠,取免疫后的脾细胞与SP2/0细胞进行融合后筛选杂交瘤细胞株,检测杂交瘤细胞株的特性并制备单克隆抗体。SDS-PAGE和Western blotting结果表明,该重组蛋白表达正确,约为20 ku,能被抗PRRSV的阳性血清特异性识别。超声后用Ni柱纯化,经SDS-PAGE分析可得单一的目的条带。NC膜皮下包埋法免疫效果良好,通过细胞融合、ELISA筛选获得3株能稳定分泌抗PRRSV N蛋白抗体的杂交瘤细胞株(H7、F7、C8),制备出高特异性的针对N蛋白的H7单抗。IFA与Western blotting结果显示制备的单抗可与病毒N蛋白产生特异性反应。亚型鉴定为IgG2b型,染色体分析证实杂交瘤细胞染色体数目正确。结果成功实现了N蛋白的原核表达,并获得高特异性的单克隆抗体,为PRRSV N蛋白抗原的检测奠定基础。 相似文献
9.
《中国预防兽医学报》2019,(3)
为了制备具有阻断能力的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体(MAb),本研究以PRRSV SD53株感染Marc-145细胞后的上清作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得一株稳定分泌抗PRRSV MAb的杂交瘤细胞株(1H4)。鉴定结果显示,1H4 MAb是Ig G1亚类,轻链为κ链。1H4细胞上清经间接免疫荧光(IFA)检测其效价是1∶40,腹水的IFA效价是1∶3 200。阻断ELISA试验显示1H4 MAb与病毒的结合能够被PRRSV阳性血清阻断。Western blot试验显示1H4 MAb可以特异性识别PRRSV的N蛋白,经截短表达N蛋白鉴定该MAb的抗原识别序列为N蛋白末端aa 107～aa 123。该抗原表位在美洲型PRRSV中高度保守,该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的PRRSV阻断ELISA检测方法奠定了基础。 相似文献
10.
为获得分泌抗禽网状内皮增生症病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,通过表达pET32a-gp90重组蛋白,以纯化的gp90蛋白为抗原,免疫BALB/c鼠,筛选分泌抗REV McAb的杂交瘤细胞株.经过细胞的融合及筛选,共获得能稳定分泌抗REV gp90的McAb细胞系2株,分别命名为A9E8和B3F8.2株细胞培养上清的效价均在1:4×102以上,腹水效价均在1∶8×103以上.亚型鉴定结果表明,2株皆为IgG型,轻链均为k链;Western blot及间接免疫荧光结果显示,这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能识别REV全病毒抗原,与其发生特异性反应,并且不与禽类其他病毒发生反应;病毒中和试验结果表明,获得的单克隆抗体均能REV临床分离株发生中和反应,具有较好的中和活性.利用制备的单克隆抗体建立了REV的间接免疫荧光检测方法,临床病料检测结果表明,该方法与病毒分离及PCR的检测结果基本一致,阴、阳性符合率分别为100％和90％.作者制备了针对REV gp90的McAb,为REV的快速诊断及抗原表位分析与鉴定等奠定了基础. 相似文献
11.
利用RT-PCR方法扩增出欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SS-6毒株的核衣壳(N)蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建了重组表达质粒pGEX-N,并将其转化到大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的诱导下获得高效表达,重组蛋白的分子量约为40 ku。用纯化的重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体。经细胞融合获得一株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,命名为1 B6,将其连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。亚型鉴定结果为IgG1型,其轻链为κ链;间接免疫荧光试验和免疫印迹试验均证明,1B6单抗既能与欧洲型PRRSV反应,也能与美洲型PRRSV反应;ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:640,腹水的效价为1:256 000,为猪繁殖与呼吸综合征的诊断奠定了基础。 相似文献
12.
相思子毒素-α单克隆抗体的制备与鉴定 总被引：2，自引：1，他引：1
用含1%甲醛的磷酸盐缓冲液对相思子毒素-a(abrin-a)减毒处理制备类毒素,以类毒素为免疫抗原分4次免疫3只BALB/c小鼠.采用聚乙二醇(PEG)法,取免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选分泌抗abrin-a的单克隆抗体(MeAb)杂交瘤细胞株.将阳性细胞株接种BAI.B/c小鼠制备McAb腹水,根据亚类鉴定结果,分别采用蛋白A或蛋白G亲和层析柱纯化腹水,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测McAb特异性,Western-blot法分析McAb抗原识别位点.结果获得1G5、3C2和4G1共3株McAb杂交瘤细胞株,均为抗abrin-a的特异性McAb,与相思子凝集素、蓖麻毒素(ricin)和蓖麻凝集素均无交叉反应,其中4G1为特异性结合abrin-a A链的MCAb,1G5和3C2两株为特异性结合abrin-a B链的MCAb;制备的MCAb可用于abrin-a含量的检测. 相似文献
13.
《畜牧兽医学报》2016,(6)
为表达与纯化具有天然构象的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)核衣壳(N)蛋白,并制备其单抗(McAb),本研究在SBV-N基因的N端加入6个组氨酸(6×His)标签后,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac~(TM)1中,构建重组供体质粒pFastBac-His-SBV-N。将pFastBac-His-SBV-N转化DH10Bac E.coli,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-His-SBV-N。将rBacmid-His-SBV-N转染Sf9昆虫细胞制备表达His-SBV-N融合蛋白的重组杆状病毒,借助Ni-NTA琼脂糖纯化重组杆状病毒感染Sf9细胞中的His-SBV-N蛋白。以纯化的HisSBV-N免疫BALB/c小鼠制备McAb,利用ELISA叠加试验检测McAb抗原识别位点的异同,并采用高碘酸钠法对识别不同抗原表位的McAb进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。最终获得了4株识别不同抗原表位的McAb(2A11、2E1、4H11和6E12)并进行了HRP标记;亚型鉴定表明,2A11为IgG1亚型,2E1、4H11和6E12均为IgG2b亚型;间接免疫荧光试验证实,4株McAb均能够识别稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系;Western blot进一步表明,HRP标记的4株McAb均与His-SBV-N蛋白发生特异性反应。His-SBV-N融合蛋白及其McAb的成功制备,为施马伦贝格病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。 相似文献
14.
牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
在MDBK细胞上增殖牛病毒性腹泻病毒(BVDV)HN-1株，用蔗糖密度梯度离心法纯化后免疫BALB／c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术，取脾细胞并与NS0骨髓瘤细胞融合，经间接ELISA筛选，3次有限稀释法克隆，得到4株能稳定分泌抗BVDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株：3A8、3C7、3C11和3E9。经鉴定，3A8、3C7、3E9株为IgG1亚类，3C11株为IgG2a亚类；杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条。3A8、3C7、3E9、3C11与BCV、BRV均无交叉反应，但3A8、3C7、3E9与HCV、BDV存在交叉反应，而3C11与HCV、BDV无交叉反应，3C11显示出较好的特异性；杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA效价分别为1：1000和1：200000，该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。这些McAb的获得为BVDV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。 相似文献
15.
猪链球菌2型人源分离株EF单克隆抗体的制备与鉴定 总被引：3，自引：1，他引：2
为了解猪链球菌2型（SS2）菌株毒力相关因子的致病机理,建立高效的免疫学检测方法,将SS2胞外因子（EF）抗原性强的区域通过基因克隆、原核表达,经亲和层析纯化的EF蛋白免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术将免疫细鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了4株分泌抗EF蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞系2G1、5H7、3H4和1F2。间接ELISA测定杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶128～1∶512,诱生腹水的抗体效价为1∶104～1∶105。4株McAb腹水的Western blot鉴定表明McAb能特异性的识别EF。以2G1单抗腹水与和EF多克隆抗血清建立的夹心ELISA可特异地检测EF。 相似文献
16.
研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的克隆表达及其特异性单克隆抗体(Mabs)的制备方法.本研究以HP-PRRSV为研究对象,参照已发表的PRRSV基因组序列,设计一对PCR引物,并在其上下游分别添加BamHI和SalI酶切位点,获得的PCR产物用BamHI和SalI酶切后与经同样处理的pET-28a原核表达载体质粒连接,转化DH5a感受态细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后,转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG于37℃诱导表达不同时间点后,取细菌菌体用SDS-PAGE分析.结果表明,Nsp2在大肠杆菌中得到表达.经包涵体的提取,用猪抗PRRSV血清抗体进行Western-bolt鉴定,结果表明,融合表达的pET28a-dNsp2蛋白能被PRRSV阳性血清特异性识别.取纯化的pET28a-Nsp2蛋白按每只100μg的剂量与等量弗氏完全佐剂进行乳化,并作为免疫原采取常规皮下多点注射免疫6-8周龄BALB/c小鼠.取其脾细胞与SP2/0的骨髓瘤细胞融合,经间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选,采用有限稀释法进行克隆.经过3次克隆后获得了一株抗PRRSV-Nsp2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为A2F1.Western-blot和间接免疫荧光结果显示这株单克隆抗体株能与Nsp2蛋白和PRRSV JXA1株发生特异性反应,而不与PRRSV CH1A株发生反应,证明获得的McAb为针对PRRSV JXA1株的McAb.抗体亚类鉴定结果表明,重链为IgG1型,轻链为κ链.采用间接ELISA法测得单抗的细胞培养上清抗体效价为1:800,腹水效价分别为1:12800.这株单抗的获得为进一步研究pET28a-Nsp2基因的功能及建立准确快速PRRSV的诊断方法提供了强有力的手段. 相似文献
17.
为制备H1N1猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),本试验利用表达猪流感病毒A/Swine/Guangdong/2004(H1N1)毒株HA蛋白的表达质粒pVAX1-HA肌注股内肌免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合;通过间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆,获得9株稳定分泌抗HA单克隆抗体的杂交瘤细胞。中和试验结果显示,单克隆抗体4D5株对H1N1流感病毒起中和作用,该单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶1024。这株单克隆抗体与哈尔滨兽医研究所国家重点实验室保存的H3N2流感病毒、H5N1流感病毒均不发生交叉反应,显示出了很好的H1特异性;间接免疫荧光试验结果显示,这株单克隆抗体能与H1N1流感病毒发生特异性反应。制备的特异性抗HA单克隆抗体为建立H1N1流感病毒免疫学检测方法和单链抗体抗病毒复制研究奠定了基础。 相似文献
18.
抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系中建立与中和效应 总被引：5，自引：1，他引：4
用提取的A型产气荚膜梭菌α毒素包涵体免疫BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合和克隆化,经间接ELISA筛选,共获得1A8,1C3,1D5,1D8,1F1,1H1和2E37株稳定分泌单克隆抗体（McAb)的杂交瘤细胞株,经鉴定,7株McAb的Ig亚类有IgG1(1D8),IgG3(1A8,1C3和2E3)和IgM（1D5,1F1和1H1）,细胞培养上清和腹水抗体效价分别为1：512-1：1024和1：10^6-1:10^8。尤为重要的是,2E3杂交瘤细胞株分泌的McAb不仅能够中和α毒素的磷脂酸C活性和溶血活性,而且能够对致死性腹腔感染小鼠产生良好的被动保护作用。 相似文献
19.
为制备针对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)P1蛋白的单克隆抗体(McAb),本研究利用重组犬瘟热病毒P1蛋白免疫BALB/c小鼠,并将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,用CDV包被ELISA板,通过间接ELISA法筛选出两株稳定分泌抗CDV-P1的杂交瘤细胞株(E9E4C10、E9F8D9)。间接ELISA检测腹水效价均为1∶106,亚类鉴定结果均为IgG2b。Western blotting和间接免疫荧光(IFA)分析结果表明,两株单克隆抗体均能与重组P1蛋白和CDV发生反应;ELISA叠加试验增殖结果表明,两株单克隆抗体识别的抗原表位不同。本研究制备的特异性抗CDV-P1的单克隆抗体为建立CDV免疫学检测方法和P蛋白的功能研究奠定了基础。 相似文献
20.
为获得高特异性的抗隐孢子虫单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),以原核表达的隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidium mouse genotype)子孢子表面抗原CP15/60为免疫原,免疫Balb/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,用间接ELISA方法进行抗体效价测定,有限稀释法进行亚克隆。以常规染色体分析法进行杂交瘤细胞的染色体分析,用McAb亚类鉴定试剂盒鉴定McAb亚型、间接ELISA法测定相对亲和力及交叉反应性、Western blot检测抗体的特异性。结果获得了2株能稳定分泌抗重组CP15/60(recombinant CP15/60,rCP15/60)的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为B4F7和D8H5,其腹水抗体效价均达到1∶107;染色体数目B4F7株为97条±4条、D8H5株为90条±7条,且观察到标志染色体;McAb亚型均为IgG1,轻链均为κ链;相对亲和力常数B4F7株为0.009μg/mL、D8H5株为0.016μg/mL;2种McAb均与rCP15/60蛋白发生特异性反应,与柔嫩艾美耳球虫卵囊可溶性蛋白、弓形虫裂殖子蛋白以及日本血吸虫虫体蛋白均无交叉反应,证实本试验获得了2株高特异性的抗隐孢子虫McAb。 相似文献