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猪MSTN基因敲除载体的构建及细胞筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
构建猪肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因的打靶载体并获得敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞.以Puro为正筛选基因,白喉毒素-A(DT-A)为负筛选基因.将同源长臂和同源短臂分别插入Puro基因的两侧.同源长短臂分别为4 294 bp和1 015 bp,定点敲除MSTN基因的部分内含子2和部分外显子3.采用FugeneHD 转染法将打靶载体转入37 d的猪胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用嘌呤霉素筛选.结果显示,成功构建了对猪MSTN基因部分区域进行敲除的打靶载体,共得到48个具有药物抗性的细胞克隆,经PCR检测,获得2个正确同源重组的细胞克隆. 相似文献
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根据绵羊、猪、小鼠和牛的Myostatin基因序列,设计引物,通过PCR方法扩增了山羊的Myostatin基因的3′臂、5′臂,其长度分别为1.4kb、4.5kb.将扩增的片段与T载体连接后进行部分序列测定,与已知发表的Myostatin序列进行同源性比较,同源性为100%.对目的片段与载体进行酶切后定向连接形成转基因结构,经序列测定后,证明其插入方向和位置完全正确,构建表达Neo、Tk基因的哺乳动物双标记转基因载体,并命名为ploxp-M . 相似文献
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牛肌肉生成抑制素基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达 总被引：2，自引：1，他引：2
将构建的牛pMD 18-T-MSTN克隆载体与真核表达载体pef-dhfr1a酶切,回收牛MSTN目的片段及pef-dhfr1a载体,构建了牛MSTN基因的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,然后转染COS-7细胞,将牛MSTN成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中进行了表达.提取转染细胞的总RNA,采用RT-PCR和Western-blotting方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了牛MSTN基因在COS-7细胞中的表达产物,证明已经成功构建出该基因的真核表达载体. 相似文献
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构建猪肌生成抑制素(MSTN)成熟蛋白编码序列的克隆与表达载体，并对mRNA进行转录水平的检测，为获得较好的猪肌生成抑制素抗原、制备抗体打下良好的基础。猪MSTN基因的cDNA去除信号肽后，用PCR扩增的1．2kb目的片段与pMDl8-T载体连接，将克隆载体的质粒DNA与同样用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ限制性内切酶酶解的表达载体pET28a( )质粒定向连接，对筛选出的阳性克隆用酶切及测序法鉴定。对猪MSTN基因成熟蛋白编码序列进行反转录，对mRNA Northern杂交进行转录水平的检测。结果，所得到的序列与所设计的序列完全一致，表明成功地进行了猪MSTN基因编码序列的克隆及筛选；目的片段定向插入，阅读框架正确；RT-PCR成功地反转录得到约1．2kb的目的DNA片段，Northern杂交后对mRNA印迹放射自显影，见到清晰的1．2kb特异带。 相似文献
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利用同源重组的原理构建了单增李斯特氏菌NrdD基因插入突变株,从大肠杆菌基因组中分别扩增出NrdD基因上下游同源臂,与pKSV7质粒相连,构建成功重组突变载体pKSV7-D1D2,将其电转入单增李斯特菌后,用氯霉素抗性平板筛选得到NrdD基因插入突变株,并对突变菌株序列测定,证明回复突变株构建成功。该突变株可在严格无氧环境中生存,为进一步研究NrdD基因功能、单增李斯特的致病机制和疫苗载体的研发奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank中牛肌肉生成抑制素（MSTN）基因序列设计了1对引物，在引物两端分别加EcoRⅠ和XhoⅠ识别位点。利用RT—PCR技术扩增出了牛MSTN功能区序列。分别构建克隆和原核表达载体，酶切、PCR鉴定及测序分析表明，该基因功能区序列的克隆载体和原核表达载体已成功构建。筛选阳性菌，经IPTG诱导，牛MSTN基因功能区在大肠埃希氏菌中成功表达。 相似文献
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旨在构建并包装打靶绵羊MSTN基因的位点特异性锌指核酸酶腺病毒表达载体,以借助腺病毒的高转染效率和非整合性以及锌指核酸酶的高效性和特异性实现对绵羊MSTN基因的敲除。本研究利用PCR扩增T2A序列和锌指核酸酶异源二聚体序列,测序鉴定后依次克隆至pAdTrack-CMV,得到pAdTrack-ZFNL-T2A-ZFNR穿梭载体,将之与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共转染至BJ5183菌株进行同源重组,以构建pAdEasy-ZFNL-T2A-ZFNR表达载体。然后用上述表达载体转染HEK293细胞进行重组腺病毒的包装,将PCR鉴定阳性的病毒进行扩增并测定病毒滴度。侵染绵羊胎儿成纤维细胞检测重组腺病毒对靶细胞的侵染能力,并用Western blot方法检测绵羊胎儿成纤维细胞中ZFN的表达,进而在细胞水平验证ZFN的活性。结果,包装得到的锌指核酸酶重组腺病毒能够高效侵染绵羊胎儿成纤维细胞并表达ZFN,腺病毒介导的ZFN可识别并切割绵羊MSTN基因。本研究成功获得靶向识别并切割绵羊MSTN基因的锌指核酸酶重组腺病毒。 相似文献
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为了构建GTPV P32基因缺失的通用GTPV转移栽体,试验根据山羊痘病毒疫苗株(GTPV-TY)的P32基因结构设计了2对引物,分别扩增得到与P32基因部分相邻的长度约为11kb的同源重组臂序列并插入到pGEM-T easy载体上,通过Smal位点重新连接,并在此位点插入CMV启动子、多克隆位点、BGH polyaA信号以及LacZ基因.结果表明,试验成功构建了通用山羊痘病毒P32基因缺失转移载体pdP32,此转移载体为改造GTPV-TY株以及开发二价或多价基因工程疫苗提供了有力工具. 相似文献
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牛肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）主要是骨骼肌生长发育的负调节因子,能够限制肌纤维的增粗增大,其前两个外显子共同编码N-端前肽,第三外显子编码C-端多肽。突变其前肽编码序列会阻止牛MSTN基因表达蛋白与相应受体的结合,导致MSTN功能失活,促进肌肉增值,但具体突变位点仍未确定。本研究设计特定的引物对牛MSTN基因编码区进行PCR扩增并进行了克隆及测序,并假定牛MSTN基因编码序列发生E1-224-A〉C点突变,通过生物信息学的方法,对牛MSTN基因突变前后编码产物的理化性质、结构与功能进行了对比分析,为MSTN基因结构与功能的研究奠定了基础。 相似文献
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试验旨在利用CRISPR-Cas9技术对蒙古牛胎儿成纤维细胞肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因进行编辑,构建无标记的MSTN基因敲除的蒙古牛细胞系,为培育肌肉发达的蒙古牛提供试验材料。通过组织块贴壁法对妊娠45 d的蒙古牛胎儿建立皮肤成纤维细胞系,同时在第2外显子区域选定1个gRNA靶位点,使用在线软件设计sgRNA序列,并选取评分较高的3个sgRNA,采用试剂盒法构建无标记的Cas9/gRNA载体,随后用T7E1酶酶切法对其进行活性验证,将有活性的载体用电转法转染蒙古牛胎儿成纤维细胞,通过无限稀释法和口吸管法将转染后的单细胞接种于96孔板扩繁后提取DNA,对其进行PCR扩增及测序验证来获取阳性细胞。本试验构建了3个无标记的CRISPR-Cas9载体,经验证1个有活性,对电转染后的单细胞进行筛选共获得96个单细胞株,测序分析后有1个单细胞株发生单碱基突变,使得MSTN基因不能编码正常的蛋白。试验成功建立了1个MSTN基因失活的细胞株,可作为后续体细胞核移植的供体细胞,用于生产无标记的敲除MSTN基因的蒙古牛,对培养产肉率高并具有生物安全性的蒙古牛具有重要的意义。 相似文献
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Full-length canine HSP70 cDNA was sequenced and the expression of HSP70 mRNA was investigated. The full-length cDNA sequence of the HSP70 gene (2322 bp) contained a single long open reading frame (1920 bp) coding a protein of 640 amino acids. The amino acid sequence of the canine HSP70 gene shared about 90-95% sequence similarity with bovine, human and mouse HSP70 proteins. Southern blot analysis with HSP70 probe gave three distinct bands of 9.4 kb, 5 kb and 4.4 kb in BamHI digests and two distinct bands of 19 kb and 4 kb in EcoRI digests. Canine HSP70 mRNA was detectable in canine peripheral blood mononuclear cells and stomach but not in liver, kidney, spleen, small intestine, large intestine and skin of dogs. 相似文献
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原癌基因c-Myc虽然在许多肿瘤组织中特异性高表达,但它也是机体正常细胞生长与增殖所必需的因子,然而目前家畜诱导多潜能干细胞（iPS）研究中关于多功能转录因子c-Myc的报道很少.为此,研究拟利用蛋白转导区域（PTD）的跨膜作用,构建TAT-bc-Myc-9R融合表达载体,并对其进行原核表达,旨在为转录因子蛋白重编程牛体细胞奠定基础.试验以牛c-Myc基因编码区序列为参考,设计并合成含酶切位点、跨膜转导肽TAT和9R的引物,利用PCR等基因工程方法获得包括牛c-Myc、TAT和9R的重组原核表达载体（pTAT-HA-bc-Myc-9R）;酶切鉴定和DNA测序结果表明,试验成功获得bc-Myc-9R重组序列,成功构建重组质粒pTAT-bc-Myc-9R;不同IPTG浓度和诱导时间条件对该重组载体的诱导表达和SDS-PAGE分析表明,TAT-bc-Myc-9R在0.6 mmol/L IPTG和37℃诱导6h条件下表达约57KDa的目的蛋白.这些结果为PTD介导的转录因子蛋白直接重编程牛体细胞以获得iPS研究积累了科学资料. 相似文献
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猪肌生成抑制素（MSTN）cDNA的克隆 总被引：1，自引：0，他引：1
从猪的肌生成抑制素（MSTN）编码序列中设计引物，以军牧一号猪肌细胞总PNA为模板，利用RT－PCR和嵌套PCR技术，扩增出MSTN cDNA片段。该片段全长1277bp，包含猪MSTN基因的全部编码序列。将所得片段与pMD18-T载体连接，转化到JM109大肠杆菌中，成功地筛选到阳性克隆，其质粒测序结果与文献报道的一致。经EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ酶解分析，cDNA片段与pMD18-T载本之间既有正向插入的克隆，也有反向插入的克隆，所得到的MSTN cDNA可用于原核和真核表达载体的构建。 相似文献
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家蚕转座子表达载体pSVHK1.4的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
研究利用PCR方法扩增黑腹果蝇 (D .melanogaster)hsp70启动子 ,然后插入到质粒pcDNA3上水母绿色荧光蛋白基因gfp的上游 ,与之顺向拼接构建成含hsp70和gfp的重组质粒pCGH。将家蚕K1 4转座子序列从pUK1 .4亚克隆到真核表达载体pSVL中PvuⅡ位点 ,获得中间载体pSK1 .4。最后将hsp70启动子和gfp报告基因的融合片段从pCGH中亚克隆到质粒pSK1 .4中K1 .4片段上的BglⅡ位点处 ,从而完成对转座子表达载体pSVHK1 .4的构建。 相似文献
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鲁西黄牛MSTN基因上游序列多态性对转录表达的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因是转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族的新成员。为了研究鲁西黄牛MSTN基因上游序列多态性与转录表达的关系,本试验提取鲁西黄牛腿肌组织细胞的基因组,扩增出MSTN基因上游序列,构建进化树并通过基因测序确定其上游序列中存在单核苷酸多态位点,多态位点位于起始密码子上游805 bp处。构建表达载体,在体外对C2C12细胞进行转染,从而验证MSTN基因上游序列多态位点对转录的影响。结果显示,MSTN基因上游序列中单个核苷酸的改变会影响其下游基因的表达水平。推测在体内MSTN基因上游序列中单核苷酸多态性能够影响基因的转录活性,在调节基因转录的过程中起着重要作用。 相似文献
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根据GenBank的核酸序列，设计6对引物自TGEV SCY株中分别扩增了长为1．5kb、2．0kb、1．1kb、1．4kb、1．4kb、1．3kb的6个片段，经克隆测序拼接后获得8495bp的TGEV部分序列。根据与其他TGEV和冠状病毒的序列和结构特征比较表明，该段序列克隆了除TGEV聚合酶基因以外的S、M、N、E、NSP3a、NSP3b、ORF7共7个基因的核酸序列；根据S、M、N基因的序列构建了系统进化树，分析表明TGEV-SCY株与TS、HN2002、TO14、pudue等毒株亲缘关系较近；密码子偏爱性分析结果认为TGEV在对密码子的使用上存在轻微的偏向性，个别氨基酸偏向于选择以A和T结尾的密码子。 相似文献