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为了进一步提高非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测方法的特异性,本研究构建了类弹性蛋白(ELP)标签与ASFV p35融合表达载体,利用相变循环分离纯化融合蛋白后,用烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)切除ELP标签,制备获得无标签p35蛋白,以此为包被抗原,通过一系列的条件摸索和优化,建立ASFV间接ELISA抗体检测方法。结果显示,ELP-p35融合蛋白的相对分子质量大小约为80 000;制备获得的无标签p35蛋白能够被非洲猪瘟阳性血清所识别;抗原包被最佳质量浓度为2.00μg/ml,待检血清最佳稀释比例为1∶200,二抗最佳稀释比例为1∶10 000,阴性和阳性判定阈值OD450为0.171;与口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和伪狂犬病毒(PRV)等阳性血清无交叉反应,特异性好;批内、批间试验结果显示变异系数都小于5.000%,重复性好;可检测400倍稀释的血清,敏感性较高;与商品化检测试剂盒(ING)检测结果的符合率高达100%。结果表明,用本研究制备的A... 相似文献
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为建立一种制备简单、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(ASFV)抗原快速检测方法,利用双表达载体pIRES在293A细胞上表达带有His标签和Flag标签的p30重组蛋白,裂解细胞后,通过免疫共沉淀发现p30重组蛋白以聚合体形式存在,进一步用质谱方法对原核系统表达纯化的p30重组蛋白进行分子量测定,结果证实,ASFV p30能自发形成二聚体。在此基础上,用抗p30的单克隆抗体6H9A10建立了单一单克隆抗体夹心检测p30二聚体的胶体金免疫层析方法,该方法对p30重组抗原最低检测浓度为2.1 ng·mL-1,对PRV、CSFV、PRRSV、PCV-2、PEDV、PPV、SVA等抗原检测结果均为阴性;用该胶体金免疫层析方法检测已知的100份临床样品,其中包含20份ASFV阴性血清、20份ASFV阴性组织、10份ASFV阴性血浆、21份ASFV阳性血清、21份ASFV阳性组织、8份ASFV阳性血浆,结果显示,检测出的48份阴性样品和49份阳性样品与已知结果一致。综上,建立的单个单克隆抗体夹心检测p30的胶体金免疫层析方法具有良好的特异性和敏感性,有望用于ASFV抗原的临床快速检测... 相似文献
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《西南农业学报》2021,(9)
【目的】原核表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)次要衣壳五邻体顶点蛋白(H240R),并研究其免疫原性。【方法】运用生物信息学软件初步预测分析H240R蛋白的理化性质、二级和三级结构。目的基因序列密码子优化后全基因合成,利用基因重组技术构建重组载体pET28a/H,通过原核系统表达目的蛋白,筛选最优的诱导温度和诱导时间。目的蛋白(包涵体)通过含2M尿素洗涤缓冲液洗涤和亲和层析进行纯化。利用梯度透析对纯化的目的蛋白进行复性,Western和Dot-ELISA鉴定复性的目的蛋白。复性蛋白和佐剂ISA201乳化后免疫小鼠,评价H240R蛋白免疫原性及其在小鼠体内诱导的抗体消长规律。【结果】生物信息学分析显示H240R蛋白分子量约为27 kDa,等电点为9.40,无跨膜结构域,抗原指数较高。成功构建大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/pET28a/H,在不同温度诱导条件下H240R蛋白均以包涵体形式表达。包涵体蛋白经过洗涤和亲和层析纯化后,纯度达85%以上。大约65%纯化蛋白可通过梯度透析进行复性。Western显示His抗体可以和融合蛋白结合显色,表明目的蛋白表达正确,Dot-ELISA显示阳性血清和复性的目的蛋白反应,表明复性的H240R蛋白具有正确的构象。复性蛋白免疫小鼠后,可刺激小鼠产生抗体,二免后10 d达到平台期,可以稳定持续30 d左右。【结论】ASFV衣壳五邻体顶点蛋白H240R在原核系统中以包涵体形式表达,纯化复性的目的蛋白具有良好的免疫原性,并且可以和阳性血清反应。这些可为进一步研究H240R蛋白的结构和功能,以及ASFV亚单位疫苗研制提供参考和思路。 相似文献
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为建立简单、经济的重组人β防御素3(HBD3)制备方法,将HBD3序列插入类弹性蛋白(ELP)与△I-CM内含肽融合表达载体,将重组载体转化大肠杆菌,20℃下用IPTG诱导融合蛋白表达,在优化条件下进行相变循环,用内含肽自裂解活性释放目的蛋白,用琼脂扩散和最小抑菌浓度法测定重组HBD3抗菌活性。结果表明:融合蛋白在重组菌中获得可溶性表达,第1轮相变循环的纯度为85.7%,再次相变循化的纯度达93.1%;内含肽裂解温度为28℃,孵育12 h裂解效率达90.3%;重组HBD3回收率达74.8%,产量为0.98 mg·L~(-1),纯度为92.6%,内毒素含量低于0.03 U·mg~(-1)(蛋白),对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有显著的抑菌活性。说明基于ELP相变循化和内含肽自裂解的重组蛋白表达与纯化系统可用于重组}tBD3的规模化制备。 相似文献
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口蹄疫病毒3AB试剂盒的检测及比较 总被引：2，自引：0，他引：2
以重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB为检测抗原,研制了口蹄疫病毒非结构蛋白ELISA检测试剂盒,该试剂盒可用于判定被检动物是否感染口蹄疫病毒。重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以辣根过氧化物酶标记的重组蛋白A/G作为第二抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法。结果表明,在1 746份免疫猪血清中,3AB-ELISA对免疫猪血清的特异性为98.68%;在1 077份健康非免疫猪血清中,3AB-ELISA对健康非免疫猪血清的特异性为98.68%;在36份人工感染猪血清中,3AB-ELISA对阳性检出率为100%。而牛的特异性的各项指标和阳性检出率分别为94.04%,97.96%和100%。猪/牛口蹄疫病毒非结构蛋白酶联免疫吸附试验检测试剂盒与国外同类试剂盒比较,阳性检出率高出12.5个百分点。 相似文献
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为了研制灵敏、准确、特异及稳定的非洲猪瘟抗体快速检测试纸产品,以非洲猪瘟病毒（ASFV）p72蛋白为检测抗原,以金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）为拦截线,对比重组蛋白p72的不同状态对试纸检测性能影响,优化标记条件、喷膜浓度、样品垫缓冲体系及成分、显色时间等因素,确定ASFV抗体检测试纸产品化的具体参数,并对试纸的特异性、均一性、准确性及稳定性进行鉴定。结果显示,试纸的检测敏感性为1∶51 200,优于商业化ASFV检测试剂盒,与其他猪源病毒阳性血清无交叉反应,变异系数小于10%,在临床样本检测中未见假阴性及假阳性结果,具有良好的敏感性、特异性、均一性及准确性;经加速稳定试验验证,可以室温保存1 a以上;与进口商品化试剂盒的总符合率为91.6%。综上,成功研制了ASFV抗体检测试纸,且试纸的检测性能良好,可以用于ASFV抗体的快速筛查。 相似文献
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【目的】利用噬菌体展示技术筛选非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)K205R蛋白的特异性纳米抗体。【方法】将原核表达、纯化的ASFV K205R蛋白免疫双峰驼，采集全血，分离外周血淋巴细胞，提取总RNA并反转录，巢式PCR扩增VHH基因，构建VHH噬菌体文库，利用噬菌体展示技术筛选K205R特异性纳米抗体。【结果】成功构建库容量为5×108的VHH噬菌体文库，然后利用噬菌体展示技术经过3轮淘选，特异性VHH噬菌体得到明显富集，氨基酸序列比对显示共筛选出5株K205R蛋白的特异性纳米抗体，分别为ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb14、ASFV-K205R-Nb35、ASFV-K205R-Nb64和ASFV-K205R-Nb82。【结论】筛选的5株纳米抗体均具有良好的特异性，其中ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb35和ASFV-K205R-Nb82具有更好的亲和力，为以纳米抗体作为灵敏探针建立的特异性强、灵敏度高、成本低的新型ASFV血清学诊断方法提供依据。 相似文献
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为了获得纯度高、特异性好的抗猪丹毒丝菌特异性IgG，采用抗原反向吸附结合重组葡萄球菌蛋白A(SPA)亲和层析法对猪丹毒丝菌阳性血清进行纯化。结果表明，血清用量对IgG的纯化结果影响不大，而细菌的用量则与IgG的获得量成正比；用猪丹毒丝菌与阳性血清吸附，初步纯化出的猪丹毒丝菌特异性IgG，再用SPA亲和层析法特异性的浓缩和纯化IgG，获得的抗体含量为240 μg/mL，即从8 mL阳性血清中获得360 μg猪丹毒丝菌特异性IgG，其纯度接近100%，可用于噬菌体展示的靶分子。
关 键 词：猪丹毒丝毒；特异性免疫球蛋白G(IgG)；猪血清；IgG纯化；纯度；重组葡萄球菌蛋白A凝胶(SPA)；SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE) 相似文献
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[目的]以原核表达的重组蛋白作为检测抗原,建立间接 ELISA方法用来检测猪血清中APP抗体。[方法]将猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体 pET-28a（＋）,构建重组质粒 pET-ApxⅡA1。将重组质粒转化至宿主菌 BL21（DE3）中进行表达。通过 Western-blot分析重组蛋白免疫原性。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立检测猪 APP抗体的间接 ELISA方法,并优化反应条件,确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释度。[结果]经 PCR双酶切及测序鉴定,重组质粒构建成功,诱导表达纯化后,重组蛋白可被 APP阳性血清特异性的识别,表明表达产物具有良好的免疫原性。用纯化的重组蛋白初步建立了检测 APP抗体的间接ELISA方法,用该方法与商品化 ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测,结果两者的符合率为90.4%。[结论]所建立的间接 ELISA 方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疫苗免疫效果评估提供了技术手段。 相似文献
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《（《农业科学与技术》）编辑部》2014,(1)
[目的]以原核表达的重组蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测猪血清中APP抗体。[方法]将猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pETApxⅡA1。将重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中进行表达。通过Western-blot分析重组蛋白免疫原性。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立检测猪APP抗体的间接ELISA方法,并优化反应条件,确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释度。[结果]经PCR双酶切及测序鉴定,重组质粒构建成功,诱导表达纯化后,重组蛋白可被APP阳性血清特异性的识别,表明表达产物具有良好的免疫原性。用纯化的重组蛋白初步建立了检测APP抗体的间接ELISA方法,用该方法与商品化ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测,结果两者的符合率为90.4%。[结论]所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疫苗免疫效果评估提供了技术手段。 相似文献
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为获得高纯度布鲁氏菌VirB12蛋白,对VirB12分泌表达蛋白先后进行亲和纯化和离子交换纯化。将其作为抗原包被ELISA板,优化反应条件后初步建立了布鲁氏菌抗体的ELISA检测方法。结果表明:蛋白纯化效果良好,重组蛋白纯度可达到98%以上。在建立的ELISA中,纯化重组蛋白的最佳包被浓度为1μg·mL-1,最适封闭剂为5%脱脂奶粉,血清最佳稀释浓度为1∶25,酶标二抗最佳工作浓度为1∶1500。对20份阳性血清及12份阴性血清的检测结果表明,其与SUANOVIR Brucella-Ab C-ELISA试剂盒的总体符合率达到90.6%,表明本试验建立的以VirB12重组蛋白为抗原的ELISA方法可以检测布氏杆菌感染抗体,有望研制成试剂盒用于养殖场布病的检测和净化。 相似文献
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猪圆环病毒Ⅱ型抗体间接ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
建立了检测猪圆环病毒2型血清抗体的间接ELISA方法,并初步应用于临床血清样品的检测.用PCR方法从PCV2 HBZX株中获得截短的核衣壳(capsid,Cap)基因,将该基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-Cap,将该重组质粒转化宿主菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3),用IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达,表达蛋白cap分子质量为42 ku,可与6×HIS抗体反应;KCl预染切胶纯化目的蛋白,以其为抗原建立检测PCV2感染猪血清抗体的间接ELISA方法.ELISA检测5份血清样品结果变异系数均小于10%.用该方法分别检测湖北、河南等地的91份临床血清样品,阳性率为25%～100%.上述结果表明,所制备的目的蛋白具有较高的纯度和良好的免疫原性,所建立的间接ELISA检测抗体方法,具有良好的重复性,初步临床试用效果良好. 相似文献
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为了制备反应原性良好的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学诊断抗原,根据ASFV p30和p54基因序列,通过大肠杆菌密码子优化后分别体外合成全长的p30和p54基因,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将2个基因片段串联,构建p30-54融合基因。将构建的融合基因片段克隆入p ET-28a(+)表达载体中,构建原核表达载体p ET-p30-54,转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达,检测融合蛋白的反应原性,并制备抗该融合蛋白的多克隆抗体。SDS-PAGE检测结果显示,表达的p30-54融合蛋白分子质量为47. 1 ku; Western blot分析显示,该融合蛋白可被ASFV阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将p30-54融合蛋白用Ni-NTA亲和层析柱纯化后免疫小鼠,成功制备了抗ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗体。 相似文献
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【目的】制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。【方法】构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。【结论】成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。 相似文献
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为了制备猪细环病毒1型(TTSuV1)抗体,并为建立TTSuV1免疫学检测方法奠定基础。用PCR技术扩增TTSuV1衣壳蛋白(Cap)基因片段,与载体pET-32a定向连接,构建重组原核表达质粒pET-32a-Cap,转化入大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导重组阳性菌表达,SDS-PAGE研究融合蛋白表达情况。对重组融合蛋白进行纯化、复性后,免疫BALB/c小鼠4次来制备鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体。分别以鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体和TTSuV1猪阳性血清为一抗,对重组融合蛋白进行免疫印迹检测。结果显示,成功表达了TTSuV1Cap截短体融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在,重组蛋白可与鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体及TTSuV1猪阳性血清发生特异性结合,表明表达的TTSuV1-Cap融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。 相似文献
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《扬州大学学报(农业与生命科学版)》2016,(3)
为制备重组犬λ干扰素(CaIFN-λ),将CaIFN-λ1成熟肽编码序列优化成大肠埃希氏菌偏爱密码子序列,将合成序列插入类弹性蛋白多肽(ELP)融合表达载体,将重组载体转化大肠埃希氏菌,用IPTG诱导CaIFNλ-ELP融合干扰素表达,用温度敏感可逆相变循环(ITC)进行纯化,用细胞病变抑制法检测干扰素活性。结果表明:重组菌能正确表达CaIFNλ-ELP,≤24℃条件下约90%表达产物为可溶性蛋白,诱导24h的表达量约占菌体总蛋白的30%;沉淀CaIFNλ-ELP的相变温度为26℃,氯化钠浓度为2mol·L~(-1),一轮相变循环后的CaIFNλ-ELP纯度为70%,离心洗涤、变性和复性后的纯度可达90%,抗病毒效价为2.5×104 U·mg-1蛋白。说明重组大肠埃希氏菌表达的CaIFNλ-ELP融合干扰素具有纯化简单、成本较低和抗病毒活性较强等优点,有望作为长效干扰素进行开发利用。 相似文献
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为了选择合理的非洲猪瘟病毒（ASFV）重组载体的激发/加强免疫策略，构建表达ASFV CD2v-p30-p54融合抗原的重组伪狂犬病毒rPRV-F1，将其与表达相同融合抗原的重组腺病毒rAd-F1分为rAd-F1/rAd-F1、rAd-F1/rPRV-F1、rPRV-F1/rPRV-F1、rPRV-F1/rAd-F1 4个组合进行猪免疫试验，分别于免疫后不同时间采血并分离血清进行ELISA抗体检测，分离的外周血单个核细胞（PBMC）经ASFV抗原刺激后进行IFN-γ检测。免疫荧光与免疫转印试验结果显示，构建的rPRV-F1能在感染细胞中正确表达F1融合蛋白。所有免疫猪均能检测到抗原特异性抗体，加强免疫后的抗体水平显著升高。在测试的4个免疫方案中，尽管rAd-F1/rAd-F1组合初次免疫后的抗原特异性抗体水平和IFN-γ表达水平最高，但加强免疫后的抗体水平和IFN-γ表达水平最低。与此相反，尽管rPRV-F1/rAd-F1组合初次免疫后的抗体水平和IFN-γ表达水平最低，但加强免疫后的抗体水平和IFN-γ表达水平最高。这些研究结果表明rPRV/rAd是较好的ASFV重组载体疫苗的激发/加强免疫策略。 相似文献
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利用可溶性重组PCV2-Cap蛋白肽段为抗原,建立PCV2血清抗体间接ELISA诊断方法(rhcap-ELISA)。将PCV2cap基因中含主要表位的片段克隆到表达载体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至18℃诱导,获得大小为34 ku的可溶性融合蛋白。Western blotting试验证实该融合蛋白具有很强的免疫学活性,通过亲和层析柱对可溶性蛋白进行纯化。用融合表达的可溶性蛋白肽段作为抗原,建立猪圆环病毒(PCV2)血清抗体间接ELISA诊断方法。该方法的交叉反应结果表明,重组抗原与PRRSV、CSF、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rhcap-ELISA和商品化的同类试剂盒(PCV2-Ab-Kit)检测137送检血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为79.56%和83.21%。因此,rhcap-ELISA猪圆环病毒抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合于在大规模的PCV2血清抗体的检测工作中使用。 相似文献
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为了获得非洲猪瘟(african swine fever virus, ASFV)p62蛋白进行血清学诊断技术研究。根据GenBank ASFV参考序列合成CP530R基因(编码p62蛋白),插入pET-32a(+)载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,SDS-PAGE及Western blot鉴定。采用Ni柱纯化p62蛋白,然后免疫Balb/c雌鼠,制备鼠抗ASFV p62蛋白的多克隆抗体,ELISA检测多抗效价。结果表明,成功构建了pET32a-p62质粒,表达蛋白为56.1 kDa,以包涵体表达为主。Western blot显示该蛋白能与ASFV阳性血清结合。Ni柱纯化获得p62蛋白浓度为2.9 mg/mL。用该蛋白免疫小鼠,三免后抗体效价达1∶256 000。表明表达蛋白具有良好抗原性,制备的p62多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,为进一步研究p62蛋白的特性和诊断奠定基础。 相似文献