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1.
从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＡＡ－２株，经常规方法提取其病毒核酸后，构建了限制性内切酶ＰｓｔⅠ及ＨｉｎｄⅢ水解片段的基因文库。对其中ＨｉｎｄⅢ－Ｆ片段（５２．９～５８．９ｍｕ）的正反２条链的序列测定发现，其反链存在１个编码容量为３８７个氨基酸（ａａ）的开放读码框架（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），经Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＥＭＢＬ同源搜寻后证实其编码产物为ＥＤＳＶ的ＤＮＡ结合蛋白（ＤＢＰ）。与其他腺病毒ＤＢＰ的氨基酸序列进行同源比较，其Ｎ端同源性在１９．０％～４６．２％之间，Ｃ端同源性在２７．７％～６０．４％之间。腺病毒ＤＢＰ的３个保守序列ＣＲ１，ＣＲ２，ＣＲ３在ＥＤＳＶＤＢＰ中有较大变化，但ＥＤＳＶＤＢＰ的锌指框架（Ｚｎ２＋ｆｉｎｇｅｒｍｏｔｉｆ）却保留了对其功能必需的残基。 相似文献
2.
减蛋综合征病毒pVⅢ基因和E3区序列测定及结构分析 总被引：9，自引：1，他引：8
克隆了减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）中国分离株基因组ＨｉｎｄⅢ－Ｅ片段，并分析了其核苷酸序列。该片段位于基因组中央５８．７～６８．９物理图谱单位（ｍｕ），片段全长共３１９４ｂｐ。其中含有１个完整的和２个不完整的开放性读码框架（ＯＲＦ），分别编码ｐＶⅢ蛋白、１００Ｋ蛋白基因Ｃ端和纤维蛋白Ｎ末端部分。ｐＶⅢ蛋白基因由７５３个碱基（ｎｔ）组成，编码２５０个氨基酸（ａａ），编码产物的分子量为２８５００。氨基酸水平的同源性比较表明，ＥＤＳＶ的ｐＶⅢ蛋白与禽腺病毒１型（ＦＡＶ１）及人和其他动物腺病毒ｐＶⅢ蛋白的同源性为２８％～３６％，而与羊腺病毒（ＯＡＶ）的同源性高达５２％，提示ＥＤＳＶ与ＯＡＶ间的亲缘关系更近。按照人腺病毒基因组结构的特征，在ｐＶⅢ和纤维蛋白基因之间，应为Ｅ３区，但该序列只有２４５个ｎｔ组成，序列中保留了ＴＡＴＡＢｏｘ和ｐｏｌｙＡ信号。但除了２个仅编码４９ａａ和３２ａａ多肽的ＯＲＦｓ外，不编码任何产物，且核苷酸序列与其他腺病毒的Ｅ３区无同源性，证实此区无明显Ｅ３区样结构。 相似文献
3.
减蛋综合征病毒全基因组DNA文库的构建及物理图谱分析 总被引：1，自引：0，他引：1
Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ Ａ Ａ２ 株纯化 Ｄ Ｎ Ａ 经 Ｈｉｎｄ Ⅲ、 ＰｓｔⅠ和 Ｓｐｈ Ⅰ水解后, 分别提取 Ｄ Ｎ Ａ 片段并克隆至ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｋ Ｓ（ ＋ ） 和ｐ Ｇ Ｅ Ｍ３ Ｚｆ （ ＋ ） 载体, 构建了 Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ 全基因文库。根据 Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 片段和基因组 Ｄ Ｎ Ａ 电泳迁移率计算, Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ 基因组大小为３２９ｋｂ , 通过克隆片段酶谱鉴定, 杂交建立了 Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ 限制性内切酶 Ｈｉｎｄ Ⅲ、 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｓｐｈ Ⅰ的物理图谱。 相似文献
4.
以非免疫鸭胚增殖的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ），经差速离心法纯化，电镜下观察到病毒无囊膜，大小为７０～８５ｎｍ。以蛋白酶Ｋ法抽提病毒基因组，琼脂糖凝胶电泳只出现１条分子量约３４ｋｂ、背景清晰的核酸带。ＨｉｎｄⅢ酶切ＥＤＳＶＤＮＡ可见１０条片段，以ｐＵＣ１９质粒为载体，采用鸟枪法对病毒基因组的ＨｉｎｄⅢ酶切片段进行分子克隆，获得１７个重组质粒，通过酶切、斑点杂交鉴定，证实已经成功地克隆到ＥＤＳＶ的５．２４ｋｂ、２．０２ｋｂ、１．６５ｋｂ、１．４７ｋｂ、１．４１ｋｂ等５个ＤＮＡ片段。 相似文献
5.
减蛋综合征病毒末端片段的克隆及细胞内DNA重组 总被引：6，自引：0，他引：6
采用９～１０日龄非免疫鸭胚增殖的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＡＡ－２毒株,经差速离心法浓缩纯化后,提取病毒基因组ＤＮＡ。采用碱变性法除去病毒基因组共价结合的末端蛋白（ＴＰ）。用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ水解纯化的ＥＤＳＶ基因组ＤＮＡ。经低熔点琼脂糖凝胶电泳后,回收Ｃ、Ｄ、Ｅ片段。克隆到ｐＵＣ１９载体的ＨｉｎｄⅢ和ＳｍａⅠ双酶切位点及ＨｉｎｄⅢ位点上,经蓝白斑筛选和单、双酶切鉴定,获得了ｐＵＨＣ、ｐＵＨＤ、ｐＵＨＥ重组质粒,其中ｐＵＨＣ含有末端片段。将ＥＤＳＶＳａｌⅠ水解产生并回收的大片段与ｐＵＨＣ在９５℃水浴中变性,６５℃复性后,用钙离子介导法,共转染５０％～７０％的单层鸭胚成纤维细胞,转染后３６ｈ开始产生细胞病变（ＣＰＥ）。４８ｈ后将病变细胞反复冻融,经尿囊腔接种９～１０日龄鸭胚,回收的尿囊液能凝集鸡红细胞,这种血凝性能被ＥＤＳＶ高免血清抑制,电镜下观察到腺病毒样颗粒。 相似文献
6.
产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的克隆与核苷酸序列分析 总被引：19，自引：5，他引：14
将含产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒ｐＫＭＡ１００用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,经１．５％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收０．９５ｋｂα毒素基因片段,再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,然后将处理好的ｐＥＴ－２８ｂ（＋）与０．９５ｋｂ的α毒素基因片段通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接,转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切分析和核苷酸序列分析,证明重组质粒ｐＸＥＴＡ１含有产气荚膜梭菌α毒素基因。确定了α毒素基因的全部核苷酸序列,并证明其具有正确的阅读框架。 相似文献
7.
产蛋下降综合征（EDS－76）病毒DNA酶切图谱分析 总被引：4，自引：0，他引：4
选用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔⅠ、ＰｖｕⅡ、ＨｉｎｄⅢ、ＢｇｌⅠ和ＢｇｌⅡ６种限制性内切酶，对国内４株ＥＤＳ－７６病毒鸡源分离株和国外标准株ＡＶ－１２７及１株鹅源腺病毒的ＤＮＡ进行酶切图谱的比较，结果发现４种鸡源分离株与ＡＶ－１２７株用上述６种酶切的片段数分别为４、８、１０、１０、６和７条。各酶切图形、片段大小亦十分相似，表明均为ＥＤＳ－７６病毒。ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔＩ－ＥｃｏＲＩ的双酶切也得到同样结果。鹅源分离株的酶切片段数分别为６、７、９、７、４和１０条，酶切图形和片段大小均与ＡＶ－１２７有很大不同，表明该分离株可能为１株血清型相同而基因组不同的ＥＤＳ－７６鹅腺病毒。 相似文献
8.
通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出了狂犬病无毒疫苗株（ＳＲＶ９）糖蛋白（Ｇ）基因膜外主要功能区的两个片段，共约７４０个ｂｐ（４５０～１１４４），含有可以诱导中和抗体的两个抗原决定簇和决定毒力及与神经细胞受体结合部位的基因片段。通过平端连接将两片段克隆到ｐＵＣ１８的ＳｍａＩ位点。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。将这一序列与已发表的狂犬病病毒ＳＡＤＢ１９株的相应序列通过计算机进行比较分析。结果证明两者核苷酸序列的同源性为９８．６％，推导氨基酸序列的同源性为９５．９％，主要抗原区内的几个重要氨基酸（如３３３位精氨酸等）发生了变异，糖基化位点也改变。 相似文献
9.
牛传染性鼻气管炎病毒tk基因的克隆 总被引：2，自引：0，他引：2
根据牛传染性鼻气管炎病毒ＬＡ株的物理图谱及Ｃｏｐｅｒ株和ＬＡ标ｔｋ基因在基因组中的定位，将ＬＡ株ＤＮＡ ＨｉｎｄⅢＡ片段中的ＳａｌＩ－ＳａｌＩ亚片段、ＢｇｌⅢ－ＳａｌＩ双酶切亚片段分别克隆到载体质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中，筛选出３个重组质粒ｐ＾ｔｋ－１，Ｐｔｋ－２和Ｐｔｋ－３，其外源片段大小分别为２．７ｋｂ，１．１ｋｂ和１．６ｋｂ。经酶切分析及同源核酸探针杂交试验表明，２．７ｋｂ ＳａｌＩ－ 相似文献
10.
减蛋综合征病毒33K蛋白基因克隆及结构分析 总被引：2，自引：0，他引：2
纯化的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＤＮＡ经ＨｉｎｄⅢ水解、０．８％琼脂糖电泳后,回收各ＤＮＡ条带并克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ载体,建立了ＥＤＳＶ基因文库,对３３Ｋ蛋白基因进行了分析。本研究证实,ＥＤＳＶ３３Ｋ蛋白基因含有２个外显子,与羊腺病毒（ＯＡＶ）３３Ｋ蛋白比较,Ｎ端编码产物的同源性为３０．８％,Ｃ端的为６０％。用ＲＴ－ＰＣＲ扩增３３ＫｍＲＮＡ和ｃＤＮＡ克隆及序列分析证实,ＥＤＳＶ３３Ｋ蛋白含有８２碱基（ｎｔ）的内含子,去掉内含子３３Ｋ蛋白基因能形成完整的ＯＲＦ,其编码产物由１７７氨基酸（ａａ）组成,推测分子质量为２．０６×１０４,与人５型腺病毒和ＯＡＶ的同源性分别为２８．１％和４４．７％。 相似文献
11.
新城疫病毒（ＮＤＶ）四平株、昌黎株、青岛株、Ｆ４８Ｅ８株分别接种９日龄ＳＰＦ鸡胚增殖，蚀斑纯化（３代），生物学特性鉴定及结合基因序列分析，表明ＮＤＶ四平株、昌黎株、青岛株均为强毒株。经差数、蔗糖密度梯度离心提纯病毒，分别提取ＲＮＡ，利用一对特异性引物及ＲＴ－ＰＣＲ方法，一次性扩增出 ＮＤＶ四平株、昌黎株、青岛株和 Ｆ４８Ｅ８株的全长 ＨＮ基因，分别将该ＨＮ基因克隆入载体ｐＫＳ（－）并进行测序。序列分析表明，这４个毒株ＨＮ基因核苷酸长度均为１７１３ｂｐ，编码５７１个氨基酸，其中四平株和 Ｆ４８Ｅ８株含有５个糖基化位点，青岛株和昌黎株含有 ６个糖基化位点，四平株含有 １２个半胱氨酸残基，而昌黎株、青岛株和Ｆ４８Ｅ８株含有１３个半胱氨酸残基。３个野生毒株与Ｆ４８Ｅ８相比较，核苷酸序列同源性为８５．７％－９９．３％，推导的氨基酸序列同源性为 ８９．５％－９８．８％，其中 ＮＤＶ四平株与标准强毒 Ｆ４８Ｅ８同源关系最近，核苷酸同源性为 ９９．３％，推导的氨基酸同源性为 ９８． ８％。 相似文献
12.
用ＥｏｏＲＩ＋ＨｉｎｄⅢ双酶解含鸡α－珠蛋白基因５′端核基质附着区（ＭＡＲ）、小鼠金属硫蛋白基因启动子（ＭＴ－１）和人胰岛素样生长因子１－（ｈＩＧＦ－１）基因的ｐＭＴＳＭＣＡＧ质粒，０．６％琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收纯化ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１片段（３．９ｋｂ），用该片段制备转基因兔。利用水平显微注射系统注射１－细胞兔胚胎４６８枚，移植到３６中受体兔，获得８只阳性兔（显示出约６００ｂｐ外源ＤＮＡ 相似文献
13.
减蛋综合征病毒基因组HindⅢ酶切片段的克隆及酶谱分析 总被引：9，自引：0，他引：9
以ＰＵＣ１９质粒为载体,采用鸟枪法克隆减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）基因组的ＨｉｎｄⅢ酶切片段,用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ标记的ＥＤＳＶＨｉｎｇⅢ片段探针打点杂交,证实１３个克隆插入了ＥＤＳＶＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢ片段。酶切分析结果表明,克隆到了Ａ、Ｂ、Ｆ、ＧＨ、Ｉ、Ｊ７个不同大小的片段,选取上述插入片段的、具有代表性的７个相应质粒ＰＵＨＡ、ＰＵＨＢ、ＰＵＨＦ、ＰＵＨＧ、ＰＵＨＨ、ＰＵＨＩ、ＰＵＨ 相似文献
14.
番鸭细小病毒M91G27株病毒结构蛋白VP3编码基因的克隆与鉴定 总被引：5，自引：0，他引：5
纯化番鸭细小病毒Ｍ９１Ｇ２７毒株鹅胚尿囊液,通过ＰＣＲ技术,从病毒ＤＮＡ中扩增出病毒结构多肽ＶＰ３完整编码基因。将该ＰＣＲ扩增片在ＨｉｎｃⅡ和ＳａｃⅡ位点克隆进ｐＵＣ１８质料载体,酶切分析筛选到含１．６ｋｂ基因片段的重组质粒ＭＰ１３,进一步对该片段进行序列及用ＣＬＯＮＥ软件分析该序列。结果结盟,其与国外已报道毒株核苷酸序列有９８．８％的同源性,氨基酸序列有９８．１％的同源性,证明该重组质粒是ＶＰ３编码基因的克隆。 相似文献
15.
本实验对鸡痘病毒２８２Ｅ４株基因组ＰｓｔⅠＨｉｎｄⅢ或ＢａｍＨⅠ片段进行了克隆、鉴定，并对部分克隆进行酶切分析，在此基础上对其中６个克隆插入Ｐ１１Ｐ７．５－ＬａｃＺ报告基因盒，构建了含报告基因的重组质粒。用其中的三个重组质粒以磷酸钙法共转染鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），其中有２个产生了蓝色空斑．经三次空斑纯化能稳定产生子代病毒．证明所使用ｐＦＢ１７６和ｐＦＨ１３３为病毒复制非必需片段，分别是２．９ｋｂＢａｍＨⅠ片段和４．７ｋｂ的ＨｉｎｄⅢ片段，并绘出了它们的物理图谱． 相似文献
16.
鸭源和鸡源减蛋综合征病毒（EDSV）酶切图谱的分析 总被引：9，自引：2，他引：9
选用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ和ＢｇｌⅠ进行鸭源减蛋综合征（ＥＤＳ）病毒（ＪＥ１株）和鸡源ＥＤＳ病毒（ＮＥ４株）的酶切图谱分析，发现鸭源ＥＤＳ病毒的这些酶切片段分别为９，４，４，６条，而鸡源ＥＤＳ病毒（ＮＥ４株）则为１０，４，４，５条，两者的酶切图形和片段大小有些不同，说明ＥＤＳ病毒宿主不同，即使血清型相同，基因型也有差异。 相似文献
17.
绵羊SRY基因的分子克隆及序列分析 总被引：3，自引：1，他引：3
本研究利用常规方法提取绵羊基因组ＤＮＡ，根据人的ＳＲＹ基因核心序列设计合成了一对引物Ｐ１、Ｐ２。用ＰＣＲ技术对公、母绵羊基因组ＤＮＡ进行体外扩增，将所扩增出的公绵羊特异性ＳＲＹ基因片段重组到质粒ＤＮＡｐＵＣ１９的ＳｍａＩ部位并转化到Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ中。挑选阳性克隆进行微溶分析，并用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ酶解。鉴定结果表明，插入片段长度与ＰＣＲ扩增带相符，约２０３ｂｐ。用Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧末端终止法测定绵羊ＳＲＹ基因核心序列的部分序列，结果表明，用ＰＣＲ分离并重组到质粒载体中的绵羊ＳＲＹ基因核心序列部分序列长度为２０３ｂｐ，这与设计完全相符。其中该序列的１５５个ｂｐ与人的ＳＲＹ基因相应序列的同源性为８２．５８％（１２８／１５５）。可见哺乳动物ＳＲＹ基因的核心序列具有高度保守性，种间差异很小。 相似文献
18.
不同传染性法氏囊病病毒分离株VP2基因部分核酸序列及其编码蛋白的比较 总被引：3，自引：1，他引：2
根据已报告的传染性法氏囊病病毒（ Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ） ｃ Ｄ Ｎ Ａ 序列,在病毒 Ｖ Ｐ２ 区域,设计 １ 对引物,并在 ２ 引物上分别加 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ酶切位点。对 ２ 个 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 分离株 Ｊ Ｓ３ 和 Ｊ Ｓ４,用异硫氰酸胍酚氯仿抽提一步法提取病毒 Ｒ Ｎ Ａ,然后进行逆转录和 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增,将扩增片段经酶切纯化后克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１８ 质粒载体中,以双脱氧链末端终止法测定 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 序列。将测定的分离株与标准对照株（ Ｓ１） Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ Ｖ Ｐ２ 基因片段的核苷酸序列进行计算机分析比较, Ｊ Ｓ３ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ４ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ３ 与 Ｊ Ｓ４ 的同源性为 ９９％ 。推导编码蛋白氨基酸序列, Ｊ Ｓ３ 和 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ４ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９６％ , Ｊ Ｓ３ 和 Ｊ Ｓ４ 的同源性为 ９８％ 。这表明在我国流行的 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 毒株与标准毒株相比不仅在免疫学反应上有差异,而且在病毒核酸序列上有变异,这种变异是造成疫苗免疫失败或免疫逃避的分子基础。 相似文献
19.
传染性法氏囊病病毒变异株主要免疫原基因cDNA的克隆及鉴定 总被引：3，自引：2，他引：1
采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），从１株传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）本地分离株ＧＺ９０２中扩增到编码ＩＢＤＶ主要免疫蛋白ＶＰ２的ｃＤＮＡ片断，大小约为１３５０ｂｐ。将该ｃＤＮＡ片断插入ｐＢｓＫ质粒中，用重组质粒转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，成功获得重组质粒转化菌。对重组质粒ＤＮＡ进行酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片断与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相符。对ＧＺ９０２高可变区进行了序列分析。其核苷酸序列与３株ＩＢ－ＤＶ变异株Ａ、ＧＬＳ、Ｅ的同源性分别达到９８．９％，９６．２％和９５．５％。而与其他Ⅰ型毒株的同源性较低。比较从ＤＮＡ序列推导出的氨基酸序列，发现ＧＺ９０２高可变区的两个亲水区均发生了一个氨基酸的变化，而在２４９和２５４位上的氨基酸分别为Ｋ和Ｓ，与以上３个变异株相同，但与所有标准Ⅰ型毒株不同。这两个氨基酸可以作为ＩＢＤＶ变异株的标志。 相似文献
20.
用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ消化ＥＤＳＶ抗原－抗体复合物、酚－氯仿抽提ＤＮＡ,得到了完整的ＥＤＳＶ基因组ＤＮＡ（约３３ｋｂ）,用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩ双酶切,得到７个片段,分别回收各片段,与双酶切线性化的ＰＵＣ１９载体质粒连接,转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α,成功地克隆了其中的５个片段。 相似文献