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1.
人生长素是由腺垂体分泌的一种在人体生长、发育及代谢中发挥重要作用的激素,具有广泛的生理作用。利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bac-to-Bac表达系统,将人生长素基因(hgh)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,通过细菌转座子原理,转化BmDH10Bac细胞,获得重组穿梭载体质粒Bacmid-hgh,并将其转染家蚕BmN细胞,获得含有hgh的重组杆状病毒。将此重组病毒感染家蚕BmN细胞,收集重组病毒液并穿刺接种家蚕5龄起蚕,3 d后观察到家蚕感染了杆状病毒的症状,并通过SDS-PAGE和Western blotting方法在家蚕血液中检测到分子质量约20 kD的目的蛋白,表明人生长素通过Bac-to-Bac系统在家蚕体内获得了表达。 相似文献
2.
为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedro virus,BmNPV)中GP41蛋白的包装功能,从BmNPV基因组中克隆了gp41基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-gfp中,构建重组转移载体pFastBac1-gp41-gfp,再利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒,在家蚕BmN细胞系中进行融合表达和定位分析。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,经重组杆状病毒r-gp41-gfp感染的BmN细胞新增一条大小为65 kD左右的蛋白条带,证明该融合蛋白在BmN细胞中成功表达。用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光充满于细胞质中,不能形成聚集体。与野生型BmNPV混合感染的实验也表明荧光出现的位置与多角体无关,说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面,融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。 相似文献
3.
利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在家蚕表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的E蛋白和M蛋白 总被引：2，自引：0，他引：2
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业的传染性病原。PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白基因是开发PRRSV病毒新型疫苗的目标基因。利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,将PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,获得重组转移质粒pFastBacHTb-E和pFastBacHTb-M,转化大肠杆菌Bm DH10 Bac感受态细胞,获得重组杆粒BmNPV Bacmid-E、BmNPV Bacmid-M,将这些重组杆粒转染家蚕培养细胞Bm5,获得重组病毒BmNPV-E和BmNPV-M。将2种重组病毒分别接种5龄起蚕,用SDS-PAGE和Western blotting方法在重组Bacmid DNA转染的Bm5细胞和感染重组病毒的家蚕幼虫血细胞中分别检测到分子质量约20 kD和18 kD的E蛋白和M蛋白,表明PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白在家蚕培养细胞及幼虫体内获得了表达,为利用家蚕-杆状病毒表达系统研制PRRSV的新型疫苗与诊断试剂奠定了基础。 相似文献
4.
将SARS-CoV S蛋白基因的部分序列(accession number为AY304495的22 908-23 542 nt区域),克隆到表达载体pET28 a(+)中,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,重组S蛋白的分子量约为27 kD,与理论分子量相符。将S蛋白基因的部分序列克隆入杆状病毒转移载体pBacPAK-H is后,与线性化家蚕杆状病毒BmBacPAK-6共转染BmN细胞,经空斑筛选获得重组杆状病毒BmBac-S,并将其在细胞和家蚕中进行表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,表达产物的分子量约30 kD,用金属螯合亲和层析纯化得到家蚕细胞表达的重组S蛋白。 相似文献
5.
轮状病毒(rotavirus,RV)是引起全球婴幼儿及幼畜非细菌性胃肠炎的主要病原体之一,VP4蛋白是轮状病毒的主要中和抗原。利用载体RD-BmBacmid与重组载体pBacPAK8-VP4共转染家蚕细胞BmN获得重组家蚕杆状病毒BmNPV-VP4,并用该病毒感染BmN细胞及家蚕5龄幼虫,从而在BmN细胞及家蚕中表达TB-Chen株轮状病毒的VP4蛋白。Western blotting检测到BmN细胞及家蚕幼虫血淋巴中均出现88 kD的特异性条带,证明VP4蛋白在BmN细胞和家蚕中获得了表达。ELISA检测结果显示,VP4蛋白在BmN细胞和家蚕幼虫血淋巴中的表达分别在感染后4 d和6 d达到最高水平,每个细胞和每mL血淋巴中的表达量分别为4.28 pg和1.61μg。研究结果为轮状病毒口服疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
6.
B7-2蛋白为免疫球蛋白超家族(IGSF)成员之一。采用PCR法从分泌鼠抗人B7-2抗体的杂交瘤细胞株克隆出该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,在VH和VL可变区基因间引入连接肽(Gly4Ser)3编码序列,体外构建抗人B7-2的鼠源单链抗体基因B7-2-ScFv。利用新型杂交病毒HyNPV的Bac-to-Bac表达系统,将B7-2-ScFv基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTa中,获得重组转移载体pFastBacHTa-B7-2-ScFv,转化大肠杆菌DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-B7-2-ScFv。将此重组杆粒的DNA转染Sf9细胞,获得重组病毒HyNPV-ScFv。感染该重组病毒的BmN细胞经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,至感染24h时目的蛋白已有表达,96h达到最高表达水平,表达产物的分子质量约31kD。用该重组病毒感染家蚕5龄起蚕,感染后96h蚕体表现出明显的发病症状。RT-PCR结果表明,5龄起蚕感染后48h,在脂肪体内已有目的基因转录,一直持续到感染后120h;SDS-PAGE和Western blotting分析表明,5龄起蚕感染96h后方可在脂肪体中检测到目的蛋白表达。构建并在家蚕中成功表达鼠抗人B7-2单链抗体,为深入研究和开发该抗体奠定了基础。 相似文献
7.
杆状病毒Bac-to-Bac表达系统由于操作简便等优点,被广泛应用于外源蛋白的表达。利用新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac系统可溶性表达一个大分子质量的融合蛋白———piwi相关基因编码蛋白PRG-1。为了提高目的蛋白的表达量,对重组病毒感染剂量及产物收获时间进行优化,并利用GST亲和层析纯化融合蛋白。结果表明在家蚕卵巢培养细胞BmN中表达的重组GST-PRG-1是可溶性蛋白;最佳的感染条件是病毒粒子对BmN细胞的感染复数(MOI)=1,并在感染后96 h收获细胞。试验结果表明,新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统可用于大分子蛋白的可溶性表达。 相似文献
8.
【目的】利用重组杆状病毒系统表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3) Cap重组鞭毛蛋白并研究该蛋白的反应原性和免疫原性,为开发PCV3亚单位疫苗提供数据支持。【方法】通过对Cap基因进行最适密码子优化并与鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因Flagellin进行融合后克隆到pFastBacTMⅠ载体。通过Bac-to-Bac系统,筛选获得重组Cap-Flagellin杆状病毒,利用SDS-PAGE、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)和Western blotting鉴定重组杆状病毒,将重组Cap-Flagellin杆状病毒免疫小鼠评价其免疫原性。【结果】重组Cap-Flagellin杆状病毒在Sf9细胞中能有效表达重组蛋白,SDS-PAGE检测可见68 ku的目的条带。IFA结果显示,重组Cap-Flagellin杆状病毒感染后72 h在Sf9细胞膜及胞浆中均出现绿色特异性荧光;Western blotting分析表明,重组蛋白能与PCV3阳性血清发生特异性反应,表明重... 相似文献
9.
为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST-E2元件的重组杆状病毒转移载体pAcSecG2T-E2,与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,筛选重组病毒(Bm-BacPAK6-E2),PCR证实所分离的重组病毒含有目的片段E2基因。SDS-PAGE图谱显示,感染重组病毒后,在细胞培养液上清和家蚕幼虫、蛹的血淋巴中均可检测到一条分子量为63 kD左右的特异性条带;感染Bm-BacPAK6-E2家蚕蛹的血淋巴可检测到GST活性,接种病毒148 h后重组蛋白的表达水平达到17.11μg/mL。 相似文献
10.
采用RT-PCR法从经LPS诱导刺激的人外周血淋巴细胞中克隆了人白细胞介素-4(human interleu kjn-4,hIL-4)基因。为高效表达hIL-4,促进其临床应用,将hIL-4插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,构建重组载体pBacPAK-hIL-4,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒BacPAK-hIL-4。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫和蚕蛹(1×10~5PFU/头),表达产物以ELISA、SDS-PAGE和Western blotting方法检测,用活化的人外周血T淋巴细胞测定表达产物体外生物活性。ELISA法结果表明hIL-4在感染病毒后96h的蚕血淋巴和120h的蚕蛹中表达量最高,分别达到2．3μg/mL蚕血淋巴和10．2μg/mL体液;SDS-PAGE、Western blotting分析表明表达产物分子量约20kD;表达产物对活化的T淋巴细胞增殖具有明显促进作用。 相似文献
11.
从人的乳腺组织中克隆了人乳铁蛋白(hLF)cDNA,其DNA序列与GenBank中另外4个hLF cDNA序列具有高度的同源性(同源性达到99%)。将人乳铁蛋白cDNA克隆在质粒pBacPAK8的BamHⅠ位点和XhoⅠ位点,构建成重组转移质粒pBacPAK-hLF。该质粒DNA与已线性化BacPAK6DNA共转染家蚕细胞BmN,在培养的贴壁细胞中挑出空斑,经过3轮纯化,获得重组病毒BmNPV-hLF。蛋白质免疫印迹法检测到在重组病毒感染的家蚕细胞中存在人乳铁蛋白基因的表达产物,分子量约78kD,ELISA法测定结果表明家蚕细胞中重组人乳铁蛋白(rhLF)相对表达量在表达120h达到最高值,约为13.5mg/L。体外生物活性试验表明重组hLF对大肠杆菌JM109具有抑菌活性。 相似文献
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人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞 相似文献
13.
传染性法氏囊病病毒VP2基因在家蚕中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
传染性法氏囊病病毒（IBDV）能引起以淋巴细胞衰竭为特征的抑制性疾病。IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是主要的宿主保护性抗原，在VP2上的点突变是造成IBDV抗原漂变的主要原因。为研究VP2作为IBDV亚单位疫苗的潜力，本实验将IBDV JD1株的VP2基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，将重组载体pBacPAK-VP2与病毒Bm-Bac-PAK6的线性化DNA共转染家蚕培养细胞，获得重组病毒BacPAK-VP2。DIG点杂交表明重组病毒基因组中含有VP2基因。重组病毒感染家蚕5龄幼虫后，用ELISA、SDS－PAGE和Western blotting检测蚕血淋巴中重组VP2蛋白的相对表达量及免疫反应性。结果表明重组VP2蛋白具有免疫反应性，感染后5－6d在蚕血淋巴中的表达量最高。 相似文献
14.
将低分子量尿激酶与膜联蛋白 (AnnexinV)的融合基因重组到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK UKAV ,并与线性化的病毒Bm PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK UKAV。将重组病毒BacPAK UKAV感染家蚕培养细胞 (MOI=10 )和 5龄幼虫 (10 5pfu/头 ) ,Western印迹方法表明表达产物大小约为 6 9kD。用纤维蛋白平板溶圈法测定表达产物的纤溶活性 ,其融合蛋白具有明显的纤溶活性 ,约为 5× 10 -5U/个细胞。用APTT法测定表达产物的抗凝活性 ,比野生病毒Bm PAK6感染表达产物的APTT时间延长了 1倍以上 ,表现出明显的抗凝活性。体外实验表明 ,家蚕培养细胞和幼虫表达的重组低分子量尿激酶与AnnexinV融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。研究结果为今后进一步探索具有溶栓抗栓功能的血栓药物提供了新的方向。 相似文献
15.
人乙肝病毒前表面抗原PreS1诱导的免疫反应可以克服机体对乙肝病毒S蛋白的无反应状态。将人乙肝病毒adr前表面抗原preS1基因克隆到杆状病毒转移载体pBacPAK8中,获得重组转移载体pBacPAKpreS1。用此转移载体与线性化病毒BmBacPAK6线性化基因组DNA共转染单层家蚕细胞(BmN),经细胞内同源重组和空白筛选,获得重组病毒。ELISA结果表明重组蛋白PreS1在家蚕培养细胞中的表达水平为02pg/个细胞,Western印迹证实此蛋白大小约为14kD。 相似文献
16.
山羊痘病毒P32基因在杆状病毒中的表达 总被引：6，自引：0，他引：6
采用PCR亚克隆了山羊痘病毒P32基因片段,将其插入杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ中,构建了重组质粒pFastBac-P32;再将该质粒转化DH10 Bac感受态细菌,进行体内重组,然后经三重抗性及蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P32;将Bacmid-P32转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒;最后用SDS-PAGE和Western-blotting对P32基因的表达进行检测.结果表明,P32基因在重组杆状病毒中获得表达,且表达产物可以被多抗所识别. 相似文献
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O型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示O型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。 相似文献