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1.
应用聚合酶链反应快速检测沙门氏菌 总被引：36，自引：5，他引：36
根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列设计引物，对沙门氏菌属A－F各群中共15株沙门氏菌标准菌株、27株沙门氏菌现场分离菌株和其他10株非沙门氏菌菌株进行聚合酶链反应（PCR）扩增，结果沙门氏菌均出现495bp特异性DNA扩增条带，所有对照均未出现特异条带，提示这对引物具有很强的沙门氏菌属特异性。PCR敏感性试验显示，该体系能检出14pg以上的沙门氏菌DNA。通过对5种不同的DNA模板提取方法的比较，选择操作简便、快速、成本低廉的热裂解法。采用该方法。采用该方法，对生鲜奶样进行检测，经与国家标准卫生检验方法相比较，两者符合率达100％。 相似文献
2.
根据沙门氏菌的invH基因序列设计1对引物,应用聚合酶链反应技术,分别对3种沙门氏菌标准菌株和5种非沙门氏菌株进行PCR扩增,结果3种标准沙门氏菌株均扩增出479 bp的特异条带,非沙门氏菌皆无特异带扩增。对3种标准株的扩增片段进行克隆及序列分析,证实沙门氏菌的invH基因序列比较保守;对19种地方分离沙门氏菌进行PCR特异性检测,结果有16株扩出特异性条带,表明本研究建立的沙门氏菌检测方法具有较高的特异性。 相似文献
3.
《塔里木大学学报》2019,(4)
基于PCR扩增的高效性,建立了以耐热核酸酶基因(nuc)为靶标基因特异性检测奶牛乳房炎性金黄色葡萄球菌的PCR方法。本实验从分离获得的205株染色为革兰阳性、形态为葡萄串状的菌株中随机选取50株进行16S rRNA基因测序和nuc基因扩增。结果显示,其中有40株葡萄球菌均可扩增出约279 bp的条带,其余10株葡萄球菌均未扩增出预期大小的条带。传统生化鉴定及16S rRNA基因测序结果表明,40株扩增出约279 bp条带的分离株均为金黄色葡萄球菌,未扩增出预期大小条带的10株菌均是葡萄球菌属的其它种。这一结果表明,nuc基因的PCR扩增可作为金黄色葡萄球菌特异性检测的分子标记。 相似文献
4.
复合PCR鉴定巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的方法 总被引：1，自引：0，他引：1
在已经建立的多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件和引物的筛选,成功地建立了PM、HIS复合PCR诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增多杀性巴氏杆菌的457 bp和副猪嗜血杆菌的1 090 bp的特异性片段.检测灵敏度分别达7.2 Pg DNA/1 040 CFU和16.0 Pg DNA/2 300CFU,用所建方法检测临床分离的23株可疑菌株和本实验室人工感染猪分离菌,结果显示,23株可疑株有2株检出多杀性巴氏杆菌特异性条带,没有检出副猪嗜血杆菌特异性条带;人工感染分离菌株均扩增出副猪嗜血杆菌特异性条带.表明该方法能够对临床上这2种疾病进行鉴别诊断. 相似文献
5.
沙门氏菌内标PCR快速检测试剂盒的研制与应用 总被引：4，自引：1，他引：3
【目的】研制一种能有效指示假阴性的PCR检测产品,用于沙门氏菌快速、准确、灵敏的检测。【方法】针对沙门氏菌invA基因、stn基因序列分别设计引物与扩增内标,建立添加扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法,组装试剂盒,并对试剂盒的各项性能进行评价。【结果】试剂盒对147株沙门氏菌和28株非沙门氏菌的检测结果显示,所有沙门氏菌均能扩增出362 bp的目标条带,非沙门氏菌仅扩增出520 bp的内标条带。试剂盒检测沙门氏菌基因组DNA的检测限为8.0 fg/PCR,检测染菌量为4—5 CFU/10 mL的牛奶样品,增菌8—10 h即得到阳性结果。反复冻融60次或-20℃下贮存1年,均不影响试剂盒的使用效果。对食品样品的检测结果显示,阳性检出率为2/30,与国标法的检测结果相符,比未添加扩增内标的PCR检测结果（阳性检出率为1/30）准确。【结论】采用添加扩增内标的PCR试剂盒检测沙门氏菌,特异性强、灵敏度高、稳定性好,并能有效指示假阴性,提高检测的准确性,适用于食品中沙门氏菌的快速筛检。 相似文献
6.
肠炎沙门氏菌特异性诊断方法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
用传统的分离鉴定方法从临床采集的12例不同蛋鸡样本中分离到1株肠炎沙门氏菌。为避免传统鉴定技术中可能出现的假阳性等问题,依据SEF 14菌毛是肠炎沙门氏菌的特异性粘附素这一特性,设计编码该粘附素基因中相对保守片段的1对引物,对上述可疑菌株进行PCR扩增,以含有编码SEF 14菌毛操纵子全基因的质粒DNA、标准株SD-2染色体DNA作为阳性对照,鸡白痢国内分离株SP染色体DNA作为阴性对照。PCR扩增结果显示分离株出现1条与预期大小498 bp一致的特异性扩增条带,阳性对照也出现相同大小的条带,而阴性对照则未出现。结合传统的细菌学分离鉴定和特定的分子生物学鉴定,将此可疑分离株确定为肠炎沙门氏菌。该方法可快速、准确、敏感地检测肠炎沙门氏菌。 相似文献
7.
【目的】建立快速检测狐阴道加德纳氏菌的PCR诊断方法。【方法】根据阴道加德纳氏菌16S rRNA基因序列设计1对特异性引物,以分离的狐阴道加德纳氏菌菌体DNA为模板进行PCR扩增,建立狐阴道加德纳氏菌的PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性及其可行性进行检验。【结果】特异性试验结果表明,狐阴道加德纳氏菌能扩增出437 bp的特异性核酸片段,而大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,PCR的最低检出限量为500 mL-1。利用建立的PCR检测方法,对9株从山东省不同地区分离的疑似狐阴道加德纳氏菌菌株进行检测,结果有4株为阳性。【结论】研究建立的狐阴道加德纳氏菌PCR快速诊断方法,敏感性高、特异性强,可1次检测多个样品。 相似文献
8.
根据玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartiisubsp.stewartii)ITS基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,对玉米细菌性枯萎病菌和非玉米细菌性枯萎病菌的标准菌株进行了PCR扩增反应.结果显示,玉米细菌性枯萎病菌的PCR产物出现301 bp的特异性扩增条带,而非玉米细菌性枯萎病菌均未出现扩增条带;其PCR检测的灵敏度为612 pg/μL.因此PCR技术是一种特异、灵敏、快速检测玉米细菌性枯萎病菌的方法. 相似文献
9.
为了鉴定某规模化兔场发生皮肤真菌病的病原,并为家兔皮肤真菌病的快速检测提供一种分子生物学方法。根据皮肤真菌特异性rDNA序列设计通用引物(5′-CACCGCCCGTCGCTACTAC-3′和5′-TTTCGCT-GCGTTCTTCAT-3′),对已知分离株及其他微生物等进行特异性检测;应用该引物对所采取的种兔患部病料35份和临床健康种兔的样本5份,进行PCR检测并克隆测序。该引物对四种常见病原性皮肤真菌分离菌株扩增出一条在400bp-500bp之间的条带,其中红色毛癣菌和须癣毛癣菌为460bp,犬小孢子菌500bp,石膏样小孢子菌为400bp,但对其它微生物和兔体细胞均未扩增出类似片段,说明具有特异性;对临床35份病料中的33份均扩增出一条460bp条带,为毛癣菌属,与测序结果一致。健康种兔的样品未扩增出类似片段。本研究利用通用引物对家兔皮肤真菌病进行PCR检测并确定其主要病原,具有快速、简便和特异性强等特点,可用于大规模的家兔皮肤真菌病的诊断,并具有重要的公共卫生意义。 相似文献
10.
[目的]建立一种能从棉花植株中快速检测黄萎病菌致病类型的方法,为黄萎病菌致病类型的大面积普查打下基础.[方法]利用Dneasy Plant Mini Kit试剂盒对落叶型标准菌株592和非落叶型标准菌株511及病圃中显症前后不同时期棉花植株DNA进行提取,然后用落叶型引物DB19/DB22、DB19/espdef01和非落叶型引物NDf/ NDr、InND2f/InND2r对所提DNA进行巢式PCR扩增.[结果]使用落叶型引物只在592菌株和落叶型病圃的病株中检测到目标条带,使用非落叶型引物只在511菌株和非落叶型病圃的病株中检测到目标条带.[结论]该试剂盒可以有效地提取棉花植株中的DNA,供试的两套引物对检测植株中棉花黄萎病菌致病类型具有高度特异性,该法可直接检测棉花植株中黄萎病菌的致病类型. 相似文献
11.
PCR法快速检测鸭疫里氏杆菌的研究 总被引：9，自引：0，他引：9
根据Gen-Bank中25株鸭疫里氏杆菌(RA)的外膜蛋白A(OmpA)基因序列,在其高度保守区设计了一对特异性引物,成功地建立了鸭疫里氏杆菌的快速、准确PCR检测方法。RA参考菌株J04(2型)、J07(JX1型)均能扩增出67lbp的特异性目的条带,而对鸭源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌、鸭源葡萄球菌的扩增结果均为阴性。PCR产物经EcoRI酶切鉴定得494bp和177bp两个预期条带。最低检出基因组DNA浓度为800fg。用全菌体进行PCR时,本实验室分离鉴定的60株RA均能够扩增出特异性目的条带。25份临床疑似病例的分离菌株的PCR扩增阳性率与生化鉴定率完全一致。该方法表明能从痫料组织培养8h的混合菌群中快速、准确地检测到RA,可用于RA的快速诊断和流行病学调查。 相似文献
12.
PCR在快速检测食品单核细胞增多性李斯特菌中的应用 总被引：3，自引：0，他引：3
为应用PCR快速检测食品中的单核细胞增多性李斯特菌,设计合成了针对单核细胞增多性李斯特菌溶血素编码基因的特异性引物进行PCR扩增.结果表明,在单核细胞增多性李斯特菌中能扩增出348bp的预期片段,大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和李斯特属的绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌和格氏李斯特菌的扩增结果均为阴性.用该方法检测了81份食品样品,检测结果与分离鉴定方法一致,表明本方法可用于食品中单核细胞增多性李斯特菌的快速检测.检测样品中,单核细胞增多性李斯特菌污染率为8.6%,以禽肉类制品中的污染率最高. 相似文献
13.
对UP-PCR(Universally Primed PCR)反应中的一些重要参数进行了优化,建立适合于玉米纹枯病菌的UP-PCR反应体系。对分离自辽宁、吉林、黑龙江等玉米主产区的22个菌株和16个标准菌株进行遗传多态性分析,筛选出7个扩增多态性好且稳定的通用引物,共扩增出105条带,其中多态性条带102条,占总条带数的97.1%。当相似系数为0.685时,可将38株镰孢菌菌株划分为10个类群,其中所有AG1-IA菌株聚为一个类群。聚类分析结果表明,供试菌株的遗传多样性与其所属融合群有着明显的相关性,而与其地理来源之间无明显的相关性。 相似文献
14.
副猪嗜血杆菌分离鉴定与PCR检测方法的建立及应用 总被引：10，自引：0，他引：10
从养猪场送检的猪肺病料中分离到3株疑似副猪嗜血杆菌(HPS)可疑菌株。经形态镜检、染色特性、生化和部分生物学特性试验,初步鉴定为HPS。在细菌学鉴定基础上,设计合成3对引物,分别以3株分离菌株的DNA为模板进行PCR扩增,结果均扩增出822 bp8、24 bp和1.9 kb的预期特异性条带。以HPS GD株作为参考阳性菌株,以P1、P2为引物,设计优化PCR反应程序,建立HPS PCR检测方法,并应用于临床病料检测。结果表明,所建立的HPS PCR检测方法特异与敏感性高、适用性强,可应用于HPS感染的诊断和检测。 相似文献
15.
鸭疫里默氏杆菌病对养鸭业危害严重,传统及常规检测方法均有不足,因此有必要建立起一种更加快速简捷、敏感实用的菌落PCR法。根据GenBank公布的鸭疫里默氏杆菌ATCC株OMPA基因序列,在基因保守区设计特异性引物,直接挑取单菌落作为模板,从分离鉴定的1,2,10,11型15株菌及1,2,10,11型4株参考菌株中均能扩增出大小为670 bp的特异性核酸片段,而对照的大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性;将培养菌用TE作10倍梯度稀释,最低检出限量为80个鸭疫里默氏杆菌;建立的菌落PCR与常规PCR法比较,两种方法均能扩增出相同的特异性条带。结果表明,菌落PCR法具有较好的特异性和敏感性,与常规PCR法结果完全一致,且更加快速简捷,在临床应用上具有更好的实用价值。 相似文献
16.
利用PCR技术快速检测水产品中副溶血性弧菌 总被引：3，自引：0，他引：3
[目的]对副溶血性弧菌的检测进行研究。[方法]采用聚合酶链式反应（PCR）,以标准菌株（单增李斯特菌、哈氏弧菌）作为阴性对照对3株副溶血性弧菌进行特异性扩增,扩增引物采用副溶血性弧菌如基因中的tlh-3和tlh-4,同时利用PCR对人工污染的白对虾中的副溶血性弧菌进行检出限测定。[结果]结果表明,通过PER扩增,副溶血性弧菌在约449bp处扩增出特异性条带,单增李斯特菌、哈氏弧菌均未出现任何条带,扩增片段表现出极好的特异性。菌液稀释到3．3×10^2cfu／ml时,将其污染到白对虾中作PCR仍可扩增出目的片断。[结论]该研究表明PER检测方法快捷、特异性好、敏感性高,可以作为副溶血性弧菌辅助检测方法。 相似文献
17.
链球菌通用PCR检测方法的建立及应用 总被引：4，自引：0，他引：4
为建立链球菌快速检测方法,根据链球菌延伸因子EF-Tu基因设计合成1对通用引物,对链球菌属及其他属细菌进行PCR检测.结果表明,所设计的通用引物对猪链球菌2型和无乳链球菌均能扩增出1条大小为197 bp的特异性DNA条带,而对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、都柏林沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌均呈阴性反应;经对PCR产物进行测序分析表明,扩增片段与GenBank上链球菌相应序列的同源性达90%～98%;对链球菌DNA样本不同稀释度的检测显示,该PCR的最低检出量可达0.1 ng/mL;利用PCR检测方法对11株链球菌分离物进行检测,结果均能扩增出与预期大小相一致的目的条带,与传统生化鉴定结果符合率达到100%.这些结果表明,已成功建立了链球菌PCR检测方法,并可应用于临床链球菌的鉴定. 相似文献
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本研究建立1种双重PCR技术,用于区分鉴定结核与非结核分枝杆菌.在最佳扩增反应条件下.检测引物P1、P2和P3、P4扩增结核分枝杆菌的特异性及敏感性,并对19株结核分枝杆菌和9株非结核分枝杆菌临床分离株进行扩增鉴定.结果表明,引物P1、P2能扩增所试13株结核和非结核分枝杆菌,P3、P4仅扩增结核分枝杆菌复合群菌种,两对引物同时扩增3种非分枝杆菌均为阴性.两对引物双重PCR检测结核分枝杆菌DNA的敏感性分别为100pg/μl和10pg/μl.检测28株临床分离株,结核分枝杆菌可扩增出368bp和225bp 2条带,非结核分枝杆菌仅扩增出一条361bp～383bp带.因此,该双重PCR技术的建立为结核及非结核分枝杆菌的快速鉴定提供了1个可供选择的手段. 相似文献
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单增李斯特菌是一种重要的人畜共患病致病菌,其传统血清型鉴定方法具有耗时长、操作繁琐等缺点,现行的多重PCR方法无法精确判定其血清型。基于基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）的快速、准确、高通量等特点,应用该技术建立了单增李斯特菌4种血清型的鉴别方法,以实现食品样品中单增李斯特菌4种血清型的高通量快速甄别。采用优化的MALDI-TOF/TOF条件对4种血清型的单增李斯特菌标准菌株和分离菌株进行检测,发现单增李斯特菌4种血清型的质谱特征峰。选取最优的支持向量机算法,建立基于1/2a、1/2b、1/2c和4b血清型差异的判别模型,运用该模型鉴别4种血清型的单增李斯特菌。初步建立了单增李斯特菌4种血清型的MALDI-TOF/TOF快速鉴别方法。以4种血清型的单增李斯特菌标准菌株为阳性对照、144株食品分离株为检测对象,运用该方法对单增李斯特菌1/2a、1/2b、1/2c、4b四种血清型鉴定符合率分别达到92.7%、90.3%、100%、100%,多重PCR方法的符合率为71.4%、87.0%、96.2%、95.0%。可见,建立的MALDI-TOF/TOF方法可对4种血清型的单增李斯特菌快速鉴别。与多重PCR方法相比,该方法具有快速、高通量、重现性好等特点,可用于食品中单增李斯特菌血清型的快速鉴定。 相似文献