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1.
伊氏锥虫HGPRT缺陷株驯化及生物学特性观察 总被引：2，自引：1，他引：1
为了获得伊氏锥虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（ＨＧＰＲＴ）缺陷株,用不同浓度的８－氮鸟嘌呤（８－ＡＧ）和８－ＡＧ加紫外线照射的方法,对伊氏锥虫体外培养株进行了为期６０～１０１ｄ诱导驯化。结果,以每毫升含８－ＡＧ４０μｇ的培养液培养驯化,再配合紫外线照射,以及以每毫升含８－ＡＧ６０μｇ的培养液培养驯化,均获得了伊氏锥虫ＨＧＰＲＴ缺陷株。试验表明,培养虫体经过２～３个死亡期后逐步进入适应期,虫数升高到（１．５～２．５）×１０６／ｍＬ,饲养细胞通常于２～５ｄ变黑、崩解,应适时更换。培养驯化的１３株克隆虫株,经６－巯基鸟嘌呤（６－ＴＧ）抗性测定,１０株存活。克隆株在３倍量氨基喋呤的ＨＡＴ选择性培养液中死亡。生物学试验表明,ＨＧＰＲＴ缺陷株在无ＨＴ的培养液中生长良好,对小鼠致病力有下隆的趋势,虫血症和小鼠死亡时间比对照组延长１倍多。抗体凝集试验表明,ＨＧＰＲＴ缺陷株未发生抗原变异现象。超微结构显示,ＨＧＰＲＴ缺陷株的动基体、核和核仁比对照组明显增大,核膜电子密度区也明显增宽。 相似文献
2.
犬肾传代细胞HGPRT缺失株的诱变 总被引：2，自引：1，他引：2
应用８－氮鸟嘌呤（８－Ａｚａｇｕｉｚｉｎｅ），通过大剂量追加细胞法、剂量递增法和紫外线预先照射交替培养法，区获得９株犬肾传代细胞系（ＭＤＣＫ）抗药细胞（剂量分别为２０μｇ／ｍＬ和５０μｇ／ｍＬ），经ＨＡＴ系统敏感性试验和６－巯鸟嘌呤抗性鉴定，其中有８株为犬肾传代细胞ＨＧ－ＰＲＴ缺失突变株（ＭＤＣＫ／ＨＧＰＲＴ＾－）。该突变株细胞Ｇｉｅｍｓａ染色后呈卵圆形，核呈圆形，８３世代细胞（ＭＤＣＫ８３／ＨＧ 相似文献
3.
伊氏锥虫体外培养株的建立及其HGPRT活性测定 总被引：5，自引：2，他引：3
用带虫培养法和带虫传代法建立了伊氏锥虫体外培养株，无论有、无饲养细胞，虫体均能快速增殖。培养７０ｄ以上，虫体仍保持原有生物学特性，对小鼠有感染性，活力旺盛，在体外能连续培养传代。虫数最高达２．４８×１０６／ｍＬ，群体增倍时间为８．８６～１０．８ｈ。液氮保存、复苏后的虫体可在饲养细胞上立即增殖。培养中发现由巨噬细胞转化的巨核母细胞对虫体生长有促进作用，经胰酶消化能与虫体一道连续传代。通过ＨＡＴ选择性培养液测定，伊氏锥虫对氨基喋呤不敏感，试验组虫体与对照一样生长良好，证明伊氏锥虫具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（ＨＧＰＲＴ） 相似文献
4.
鸡传染性支气管炎病毒华南分离株核蛋白基因的序列测定及同源 … 总被引：8，自引：4，他引：4
根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）核蛋白基因序列，设计并合成１对引物。应用这对引物，以ＲＴ－ＰＣＲ特异性扩增出华南分离株（ＨＮ株）的核蛋白基因，基因产物大小为１．５ｋｂ，与设计相符。对ＨＮ株部分核蛋白基因进行序列测定，并与标准毒株Ｈ５２，Ｍ４１，Ｂｅａｕ和Ｇｒａｙ的核蛋白基因进行同源性比较，结果表明，ＨＮ株与Ｈ５２、Ｍ４１、Ｂｅａｕ和Ｇｒａｙ株的核酸同源性分别为８５％、８４％８４％和８ 相似文献
5.
本试验直接从细胞培养液中提取猪瘟兔化弱毒（ＨＣＬＶ）ＲＮＡ，并根据猪瘟病毒（ＨＣＶ）Ａｌｆｏｒｔ株和Ｂｒｅｓｃｉａ株的核苷酸序列，将ＥＩ基因分两段，设计并合成了４条引物。采用反转录－多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ），成功地扩增出了ＨＣＬＶ保护性囊膜糖蛋白ＥＩ基因。以ｐＧＥＭ－Ｔ和ｐＵＣ１９为载体，将ＥＩ基因的两个片段分别进行克隆并转化到大肠杆菌ＪＭ１０１。经过分析鉴定，证明所扩增的片段为ＨＣＬＶＥＩ基因 相似文献
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腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒变异株的比较研究 总被引：4，自引：2，他引：4
腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）变异株Ｈ９５提纯样品经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ,证明Ｈ９５株单抗ＤＥ７和Ｍ４１株单抗６ＤＨ８均能识别Ｈ９５株５４０００蛋白多肽。采用单抗、多抗介导间接ＥＬＩＳＡ试验表明,Ｈ９５毒株能与抗ＩＢＶＭ４１Ｎ蛋白单抗６ＤＨ８和ＩＢＶＭ蛋白单抗ＭＣ发生反应,也能与抗Ｍ４１、Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ、Ｔ、Ｈ５２、Ｎ１１５和分离株Ｃ９００１、ＤＬＺ９１１１的多抗血清反应,同时抗Ｈ９５株的４株单抗、多抗血清也能与上述毒株反应。卵磷脂酶Ｃ处理的Ｈ９５株的血凝活性能被相应的Ｈ９５株的单克隆抗体和高免血清所抑制,也能被Ｍ４１单抗和高免血清所抑制。通过ＲＴ－ＰＣＲ获得了Ｈ９５毒株的免疫原基因Ｓ１,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ和ＩＢＶ的Ｓ探针检测呈阳性。 相似文献
7.
将伊氏锥虫在体外与人血清一起培养，虫体出现渐进性水肿，由蝌蚪形变成环形，最后崩解。将人血清注入感染鼠体内，可以清除体内虫体，使感染鼠得到保护。人血清对接种１０３个锥虫感染鼠的最小保护剂量为０．２ｍＬ，感染后５ｄ注入人血清，血中虫体数量逐日下降，至第１０天全部消失。对体外伊氏锥虫不同变异株，人血清均有同样的溶虫效果。经ＤＥＡＥ层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００过滤后，人血清中只有富ＩｇＭ的Ｆ－１有溶虫活性，而富ＩｇＧ的Ｆ－２和富ＨＤＬ的Ｆ－３均无溶虫活性，表明人血清对伊氏锥虫的溶虫活性与ＩｇＭ类天然抗体有关。另外，去补体的人血清体外溶虫活性明显减弱，而体内保护仍然有效。 相似文献
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新城疫病毒F48E8株血凝素—神经氨酸酶基因的克隆与鉴定 总被引：16，自引：1，他引：15
应用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）获取新城疫苗病毒Ｆ４８Ｅ８株的血凝素－神经氨酸酶基因。扩增反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，长约１．９３ｋｂ与预期结果相符，将其克隆入质粒载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）中，经限制性内切酶分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实为新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８株的血凝素－神经氨酸酶基因。 相似文献
9.
旋毛虫不同株同工酶比较的研究 总被引：2，自引：1，他引：1
本文对７株旋毛虫６种同工酶进行了分析比较，各株旋毛虫原始虫科分别来自哈尔滨，长春，天津，河南邓县，新野，云南保山及西安。除长春株畜主为犬外，其余均为猪。采用ＩＥＦ电泳，分别显示６种酶：ＧＰＩ，ＰＧＭ，Ｇ６ＰＤＨ，ＭＤＨ，ＡＬＡＴ及ＡＳＡＴ。结果长春犬株与哈尔滨猪株在ＧＰＩ，ＰＧＭ，Ｇ６ＰＤＨ，ＭＤＨ，ＡＳＡＴ５种酶的同工酶谱均有差异。同工酶分析及长春犬与哈尔滨猪株在其它生物学特征方面的差异提示它们 相似文献
10.
伊氏锥虫抗独特型抗体疫苗的研究：Ⅰ.伊氏锥虫变异表面糖蛋白的提… 总被引：2，自引：0，他引：2
采用ＤＥ－５２纤维素离子交换层析从实验感染大白鼠血液中提纯伊氏锥虫，－２０℃反复冻融，超声波裂解和超速离心制成可溶性抗原，经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０脱盐后进行ＤＥ－５２纤维素氯化钠梯度离子交换层析从中纯化变异表面糖蛋白。经鉴定是一种分子量为３０ＫＤ，富含碱性氨基酸的蛋白质，具有较高的纯度。免疫原性试验证实是伊氏锥虫广西骡株的保护性抗原。 相似文献
11.
根据GenBank上公布的金黄色葡萄球菌肠毒素A（staphylococcus enterotoxin A,SEA）基因的全序列,设计一对特异性引物扩增内蒙古分离株的SEA基因序列。经基因克隆和序列测定,表明扩增的基因片段长度为582 bp,与标准菌株ATCC13565的SEA基因片段序列相似性为100%,与GenBank上公布的金黄色葡萄球菌菌株（EF520720.1）SEA基因相似性达到99.14%。本研究结果为进一步研究建立牛乳中SEA分子检测技术奠定了实验基础。 相似文献
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羊流产衣原体主要外膜蛋白基因的克隆与序列分析 总被引：6，自引：0，他引：6
将自行分离、传代培养的内蒙古地区山羊流产衣原体按常规方法分离纯化，提取衣原体基因组DNA作为模板，按照国外发表的衣原体主要外膜蛋白（MOMP）基因两端序列设计合成一对引物，用PCR方法扩增出－1.17Kb的DNA片段。利用引物上预先设计的限制性内切酶位点，将扩增片段经限制性内切酶切割后连接到pUC19质粒相应位点上，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组子。经PCR检测和内切酶分析鉴定含MOMP基因的重组子质粒。对克隆处段进行全序列分析，结果证明得到MOMP全编码序列的基因克隆。本株衣原体MOMP编码区由1170个核苷酸组成。序列比较发现本株衣原体的MOMP基因与国外的羊流产衣原体S26／3株的MOMP基因完全相同，与B577株的MOMP基因仅有一个核苷酸的同义变异。 相似文献
13.
为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase,Pgk）基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因（AE009948）核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体Pgk-pET30a（＋）,再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2＋亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。 相似文献
14.
根据已发表的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,Ah）溶血素A基因序列设计一对特异性引物,以TPS30菌株基因组为模板,通过PCR扩增溶血素A基因,经T-A克隆、序列测定和分析,结果表明,该基因包含1482 bp碱基,编码494个氨基酸。将溶血素A定向克隆至表达载体pET32a（＋）中,构建重组表达质粒pET-THA,在IPTG诱导下成功获得重组表达蛋白His-GroEL,大小为68 kDa。对该质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达特性分析表明,最佳的诱导表达条件为：在0.1 mmol/L的IPTG浓度下,21℃诱导表达3 h。表达的溶血素A蛋白纯化后免疫小鼠,经Western blot检测,表明该蛋白具有免疫原性。对纯化的溶血素A蛋白复性后,进行溶血实验,结果表明该蛋白具有溶血活性。通过本实验的研究,为进一步研究嗜水气单胞菌溶血素的生物学功能奠定了基础。 相似文献
15.
猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆及在原核细胞中的表达 总被引：8，自引：0，他引：8
应用ＲＴ－ＰＣＲ分两段扩增猪瘟病毒（ＨＣＶ）石门株Ｅ２基因,然后对其进行了克隆。利用两个片段重叠部分的单一ＢｇｌⅡ位点,将它们连接成为完整的Ｅ２基因,并克隆到ＰＵＣ１９质粒中,获得重 质粒ＰＨＣＦ２。另设计一对引物,以ＰＨＣＦ２为模板扩增出不含信号肽的Ｅ２基因,然后将其克隆到表达载体质粒ｐＢＶ２２０和ＰＥＴ＿２８ａ（＋）中,获得重组质粒ＰＢＶＥ２和ＰＥＴＥ２,用酶切,ＰＣＲ和序列分析鉴定Ｅ２基因插 相似文献
16.
伊氏锥虫、马媾疫锥虫、布氏锥虫、刚果锥虫的18S rDNA部分序列测定与系统发育关系 总被引：2，自引：1，他引：2
对伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）：新疆株（XJCA）、湖北株（HBM）、云南株（YNB）、广东株（GDB2）；马媾疫锥虫（Trypanosoma equiperdum）、布氏锥虫（Trypanosoma brucei）、刚果锥虫（Trypanosoma congolense）提取基因组DNA，根据已报道的伊氏锥虫株18SrDNA基因序列设计合成引物，用PCR扩增了锥虫虫株基因组DNA,伊氏锥虫新疆株、湖北株、云南株、广东株、布氏锥虫、刚果锥虫均为373bp的片段；马媾疫锥虫为372bp的片段，PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化，纯化后PCR产物经连接、转化后测序，将测得的序列用DNAMAN软件分析并与国外已发表的相应序列进行了同源性比较，并绘制了系统发育进化树。结果与国外AJ009153、AJ223564、D89527株同源性达到99％～100％，与另外11株同源性75％。本研究为锥虫分子流行病学研究及分类研究打下基础。 相似文献
17.
裂殖子表面抗原蛋白家族因其高抗原保守性常作为马泰勒虫ELISA检测方法的基质。本研究根据马泰勒虫EMA2基因序列合成引物,以马泰勒虫新疆株DNA为模板,扩增获得目的基因,将其连接至pEASY-E1载体构建重组质粒pEASY-E-TE,并转化至大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达重组EMA2蛋白并鉴定。结果显示:PCR扩增获得了约819bp特异性DNA片段,构建了pEASY-E-TE重组质粒,成功诱导表达了35kDa的可溶性目的蛋白;经SDS-PAGE、Western blot鉴定,重组蛋白rEMA2具有良好的抗原性。本试验克隆表达的重组蛋白rEMA2可为ELISA方法的建立及后期研究提供靶基因材料。 相似文献
18.
为研究牛支原体(M. bovis)临洮分离株(LT strain)NOX-1基因特征表达产物的酶活性,及其在细胞中的具体存在部位,参照GenBank中M. bovis NOX-1HuBei株NOX-1基因序列(GenBank登录号:NC015725.1)设计引物,应用PCR扩增M.bovis临洮株的NOX-1基因,在完成测序后构建NOX-1基因原核表达载体pET-NOX-1,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达。表达产物纯化后进行酶活测定并免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,继而应用Western blot及间接ELISA对NOX-1在M. bovis内的分布进行初步定位。结果显示,M. bovis临洮株NOX-1基因全长1365 bp,重组质粒经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,重组蛋白His-NOX-1的分子量约为50 kDa;重组蛋白酶促反应最适酶促温度为30℃、pH为7.5,双倒数法求得重组蛋白Km和Vmax分别为256.41μmol/L、34.25μmol/(L·min);Western blot及间接ELISA结果表明His-NOX-1在M. bovis细胞膜上和细胞浆中均有分布且胞浆含量较高。本研究结果为进一步研究M. bovisNOX-1的生物学功能奠定了一定的基础。 相似文献
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犬附红细胞体PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
目的 步建立犬附红细胞体PCR检测方法。方法 据已发表的附红细胞体基因序列,设计了一对特异性引物,以犬附红细胞体基因组DNA和附红细胞体可疑病犬样品DNA为模板,聚合酶链式反应（PCR）扩增,扩增产物经克隆测序分析。结果 CR扩增产物大小为541bp,序列分析表明与GenBank数据中发表的序列一致,表明这套引物成功扩增出目的基因序列,但正常犬血样品DNA和弓形虫、伊氏锥虫、吉氏巴贝斯虫、犬细小病毒、犬瘟热的DNA样品都不能扩增出目的基因片段。结论 研究建立的PCR方法可以用于犬附红细胞体的检测,为犬附红细胞体病的诊断及分子流行病学的调查提供了新的手段。 相似文献