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猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及抗E2蛋白单克隆抗体的制备 总被引：4，自引：1，他引：4
利用DNA重组技术将猪瘟病毒（CSFV）石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞术（FACS）分析,结果表明CSFV E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达.将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体.取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经克隆和筛选获得了4株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗可与CSFV产生特异性反应并具有中和活性. 相似文献
2.
为拯救囊膜表面携带有猪瘟病毒E2蛋白的复制型水疱性口炎假病毒,共转染分别表达水疱性口炎病毒核衣壳蛋白、磷蛋白、聚合酶蛋白以及携带有猪瘟病毒E2基因的复制型水疱性口炎病毒载体于BHK-21细胞中.采用Western blot、间接ELISA以及体外微量中和试验检测和鉴定拯救的假病毒.结果显示,E2蛋白成功地在BHK-21细胞中表达,假病毒VSV/CSFV-E2免疫的Balb/c小鼠血清中有高滴度的抗E2抗体,假病毒诱导产生的抗体在体外可以有效的阻断猪瘟病毒囊膜蛋白E1和E2蛋白假型的病毒HIV-luc/CSFV-E1&E2对PK-15细胞的感染. 相似文献
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猪瘟病毒石门株E2基因在永生化猪血管内皮细胞的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
利用DNA重组技术将猪瘟病毒石门株囊膜蛋白E2基因定向插入逆转录病毒载体pBABE-puro中,构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2。将pBABE-puro-E2和辅助质粒pVSV-G经磷酸钙共沉淀法转染293GP包装细胞系,将其包装为完整的逆转录病毒假病毒;用包装好的假病毒在polybrene的介导下转导第30代的永生化猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）,用嘌呤霉素筛选阳性细胞,并将筛选出的阳性细胞腹腔免疫BALB／c小鼠。RT-PCR检测SUVEC内的E2基因,用间接免疫荧光试验鉴定E2蛋白在SUVEC上的表达,间接ELISA试验检测小鼠血清抗体。结果表明,CSFVE2基因导入猪脐静脉血管内皮细胞获得表达,而且成功诱导小鼠产生抗E2蛋白的抗体。 相似文献
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应用假病毒和假型病毒制备抗猪瘟病毒E2蛋白中和性单克隆抗体的初步研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备抗猪瘟病毒(CSFV)单克隆抗体(MAb),本实验以表达CSFV E2囊膜糖蛋白的水泡口炎假病毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合;利用间接ELISA方法和携带荧光素酶(Luciferase)报告基因的HIV-luc/CSFV-E1E2假病毒系统筛选分泌中和性E2MAb的杂交瘤细胞;测定MAb亚型并纯化后,间接ELISA方法测定MAb的效价;采用western blot鉴定MAb的特异性亲和力;利用HIV-luc/CSFV-E1E2假病毒进行体外中和试验,分析MAb抑制病毒感染的能力。结果表明本实验获得了1株分泌中和性MAb的杂交瘤细胞9C8,该MAb能与E2蛋白特异性结合,而且体外抑制试验中和效价大于1∶25600。 相似文献
5.
牛病毒性腹泻病毒梅花鹿分离株E0基因的克隆与表达 总被引：2，自引：0，他引：2
利用RT-PCR技术扩增了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)梅花鹿分离株E0基因，并将其克隆到pMD18-T克隆载体和pET28a原核表达载体中，构建了pMD18-T／E0和pET28a／E0重组子，并进行了测序和表达。表达产物分别用12％SDS-PAGE检测和牛抗BVDV阳性血清进行Western-blotting检测，结果表明．BVDV梅花鹿分离株E0基因的核苷酸序列与匈牙利VEDEVAC株的同源性高达98．6％，与C21V标准株的同源性为84．9％，证明构建的重组子是正确的；BVDV梅花鹿分离株E0基因得到了正确表达。 相似文献
6.
为构建包装含有H1亚型流感病毒HA蛋白的伪型病毒,本研究将人工合成的H1N1流感病毒(A/Califorma/04/2009株)血凝素(Hemagglutinin,HA)基因连接至真核表达载体pcDNA3.1,该重组质粒与表达逆转录病毒相关元件的骨架质粒pHIT111及pHIT60共转染人胚胎肾细胞293T,构建了以鼠白血病病毒为核心、包装含有HA蛋白的伪型病毒.通过对伪病毒感染细胞中LacZ报告基因表达产物的检测,证明伪病毒可以感染MDCK细胞;同时其感染过程可被流感病毒免疫后的小鼠阳性血清所阻断,表明该伪型病毒可模拟野生型病毒完成对宿主细胞的感染过程.本研究所构建的伪病毒系统为研究H1亚型流感病毒HA蛋白抗原特性及新型中和抗体检测方法的建立提供了理想的工具. 相似文献
7.
串联表达猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)E0和E2蛋白，并制备多克隆抗体鉴定其免疫原性，为进一步研究亚单位疫苗和猪瘟ELISA抗体检测方法提供材料。应用PCR技术分别扩增CSFV E0和E2基因片段，运用重叠PCR将其串联扩增后克隆至pET-28a载体，构建重组表达质粒pET-28a-E0+E2。通过大肠杆菌表达系统表达重组蛋白E0+E2,切胶纯化后免疫昆明小鼠制备血清，通过间接ELISA方法测定抗体水平，间接免疫荧光(IFA)分析多克隆抗体的免疫原性和特异性。结果显示，37℃,1 mmol/L IPTG诱导条件下，E0+E2蛋白能够以包涵体形式表达，经纯化复性后免疫小鼠，制备的血清能与感染CSFV的细胞特异性反应。在大肠杆菌中高效表达了E0+E2蛋白，制备的多克隆抗体具有较高的特异性和反应性。 相似文献
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猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。 相似文献
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为表达猪瘟病毒E0蛋白并制备其多克隆抗体,本研究构建E0蛋白的原核表达载体,转化至BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达,亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示E0重组蛋白主要以包涵体形式表达,亲和层析纯化获得了E0重组蛋白,用其免疫Balb/c小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA显示,免疫小鼠血清中E0蛋白抗体效价为1∶50 000。获得的E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及E0-EGFP融合表达细胞中天然结构的E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。 相似文献
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猪瘟病毒E0和E2蛋白融合表达的重组腺病毒构建及免疫保护性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为评价重组腺病毒融合表达猪瘟病毒(CSFV)E0和E2蛋白的免疫保护效果,本研究以CSFV基因组为模板,应用RT-PCR扩增E0和E2蛋白的编码基因,通过pET-32a载体将E0和E2基因串联,形成pET-E0-E2重组质粒。用KpnⅠ和NotⅠ双酶切pET-E0-E2得到E0-E2融合基因,定向亚克隆于穿梭载体pAdTrack-CMV中,采用"两步转化法"在细菌内同源重组,构建携带E0-E2基因的重组腺病毒转移载体质粒pAdEasy-E0-E2,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚胎肾细胞(HEK293),成功包装出重组腺病毒(rAd-E0-E2),PCR和western blot检测表明,E0-E2基因已重组于腺病毒基因组中并获得表达。将rAd-E0-E2接种于小鼠和猪,并通过ELISA进行抗体检测。另外,将rAd-E0-E2经肌肉2次(间隔7d)免疫接种6周龄～7周龄猪,3周后用103TCID50CSFV石门株攻毒。结果表明,rAd-E0-E2免疫组6/7头存活,各组织器官带毒时间不超过10d,而非重组腺病毒rAd-CMV免疫组和空白对照组全部死亡,各组织器官均能分离到CSFV。结果提示,rAd-E0-E2能使免疫猪抵抗CSFV强毒攻击,为进一步研制猪瘟基因工程疫苗提供了实验依据。 相似文献
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Neumann EJ Grinberg A Bonistalli KN Mack HJ Lehrbach PR Gibson N 《Veterinary microbiology》2009,138(3-4):297-303
The porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is an enveloped RNA virus. Virions of PRRSV contain six membrane proteins: the major proteins GP5 and M and the minor proteins GP2, GP3, GP4, and E. The GP5 is the major envelope proteins, which was involved in the formation and infectivity of PRRSV by coaction with other membrane proteins. Here, to determine the function of alone GP5 envelope protein in viral entry, we investigated the formation and infectivity of GP5-pseudotyped virus particles. By co-transfection of GP5 expression plasmids with murine leukemia virus (MuLV) based retroviral vectors (pHIT60, encoding MuLV Gag-Pol; pHIT111, encoding an MuLV genome with a β-galactosidase reporter gene) into 293 T cells and analysis of the culture medium using ultracentrifugation, Western blot, and infection assay. We observed that the GP5 envelope protein was incorporated into the MuLV retroviral vectors to generate an pseudotyped murine leukemia virus, which was infectious to PAM and Mack-145 target cells and displayed the same host range with wild-type PRRSV. The infection of the pseudotyped virus on PAM target cells is effectively neutralized by polyclonal antibodies specific for PRRSV or GP5. The results suggested that the GP5 protein may play a key role in the viral entry by interacting with the host cell receptor. The GP5-pseudotyped virus will be useful in the identification of the cellular receptor binding with GP5 protein. 相似文献
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Glycoprotein B (gB) of bovine herpesvirus 1 (BHV-1), a major component of the viral envelope, is essential for membrane fusion during entry and cell-to-cell spread. It is cleaved in the trans-Golgi network by the proprotein convertase furin. Integration of the open reading frame (ORF) encoding a mutated gB with a second furin cleavage site and mature boIFN-α as intervening peptide between the amino-terminal (NH2) and carboxy-terminal (COOH) gB subunits yielded recombinant BHV-1/gB2FuIFN-α which, unexpectedly, express gB with an enlarged NH2-subunit of 90 kDa. Here we show that boIFN-α-specific antibodies bind to the 90 kDa gB subunit and efficiently neutralize BHV-1/gB2FuIN-α infectivity. We also show that inactivated BHV-1/gB2FuIN-α virions induce an antiviral state in cells incubated with UV-inactivated particles. These results demonstrate that the 90 kDa protein is a NH2-subunit/boIFN-α fusion protein whose boIFN-α domain is biologically active. To verify that BHV-1 gB is suitable for the display of (glyco)proteins on the surface of virions we constructed BHV-1 recombinants expressing within gB the first 273 amino acids of the NH2-subunit (HA1) of avian influenza haemagglutinin, either flanked by two furin cleavage sites or with only one cleavage site between a gB/NH2_HA1 fusion protein and the COOH subunit. The resulting recombinant BHV-1/gB2FuHA1 expressed gB from which 55 kDa HA1 was excised and secreted. In contrast, gB from BHV-1/gB_NH2HA1 infected cells retained HA1 as fusion protein with the NH2-subunit. Immunoblotting and neutralization analyses revealed that HA1 is incorporated into the envelope BHV-1/gB/NH2_HA1 particles and exposed to the exterior of virions. Thus, this novel approach enables display of polypeptides and (glyco)proteins of at least 273 amino acids on viral particles which is of particular interest for development of novel diagnostics and vaccines as well as for, e.g. gene therapy applications especially when biologically active ligands need to be presented. 相似文献
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为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-EGFP和E56-EGFP的重组病毒,在家蚕卵巢培养细胞系(BmN)中进行表达和定位分析。结果表明2种融合蛋白均在BmN细胞中成功表达,并于荧光显微镜下观察到绿色荧光主要分布在细胞核中。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体也能激发出绿色荧光,用Western blot方法进一步证实多角体中含有融合蛋白。这一现象表明当囊膜蛋白基因与外源基因融合表达时,外源融合蛋白能够进入多角体内部,推测这2种ODV囊膜蛋白不仅在病毒粒子包涵入多角体的过程中起信号引导作用,并能引导外源目的蛋白进入多角体。 相似文献
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为制备抗东方马脑炎病毒(EEEV)结构蛋白E2的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以Bac-to-Bac真核表达系统表达EEEV E2蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合.以原核表达载体pET-30a表达并纯化的EEEV E2蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,获得4株稳定分泌抗EEEV E2蛋白MAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为6F3、6F11、7C11、8B11.Western blot与间接免疫荧光试验结果表明,获得的4株MAbs均与EEEV呈阳性反应,而与西方马脑炎病毒、乙型脑炎病毒以及登革热病毒1型～4型呈阴性反应.利用部分重叠的原核表达的短肽对E2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 6F11、7C11和8B11识别的抗原表位均为E-33 (321EGLEYTWGNHPPKRVW336),而MAb 6F3无短肽与其反应,推测可能为构象表位.本研究结果为建立EEEV型特异性检测方法、研究E2蛋白结构功能及该病的进一步防制奠定了基础. 相似文献
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以禽流感病毒A/Chicken/Hubei/327/2004(H5N1)免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验筛选细胞培养上清,采用有限稀释法对阳性孔进行克隆,3次克隆后获得7株能稳定分泌抗H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1C4,1D4,1E12,2E11,4C12,4G2和5E12。细胞培养上清HI效价为24~27,腹水HI效价可达210~218。所有单抗与禽流感H7和H9亚型标准血凝抗原,新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒无交叉反应。在细胞上的中和试验显示具有较高的中和效价,获得的单克隆抗体可在禽流感流行病学的监测中发挥重要作用。 相似文献