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致泻性大肠杆菌可引起大熊猫血水样便、休克，严重者可危及生命。为准确鉴定4种致泻性大肠杆菌病原，本研究通过对引物浓度、退火温度、反应条件等进行优化，建立了能同时检测EPEC和EHEC的多重PCR方法以及ETEC和EAEC的多重PCR方法。结果得出：两种多重PCR方法特异性强，仅对特有的毒力基因进行扩增，对其他10种大熊猫源病原菌的扩增结果均为阴性；敏感性较高，细菌基因组DNA检测中EHEC和EPEC的检测下限为2.71×104拷贝/μL,EAEC的检测下限为3.23×104拷贝/μL,ETEC的检测下限为3.23×103拷贝/μL；菌液检测中EPEC和EHEC的检测下限为1.85×104CFU/mL,ETEC的检测下限为2.9×103CFU/mL,EAEC的检测下限为2.62×104CFU/mL；不同时间段重复8次，均扩增出对应的目的条带，证明重复性好。利用多重PCR和单一PCR方法分别检测110份样品，结果得出esc V基因阳性率为1.82%(2/110)... 相似文献
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张耀东 朱红 AFAYIBO Doss&# h Jean Ap&# tre 王瑶 易正飞 信素华 陶程琳 李涛 祁晶晶 田明星 丁铲 于圣青 王少辉 《畜牧兽医学报》2020,51(12):3193-3198
本研究旨在建立β-内酰胺类、四环素类、氨基苷类、酰胺醇类、磺胺类抗菌药物耐药基因的多重PCR检测方法,用于耐药基因的快速检测。根据GenBank公布的上述5类抗菌药物的耐药基因序列,设计17对特异性引物。通过优化PCR体系和反应程序,建立4组耐药基因（cat+floR+tetB+tetC;dfrA12+sul2+sul1+blaCTX-M+balTEM-1;aac3+aph3+aadA1+strB;tetA+cmlA+strA+sul3）的多重PCR反应体系。然后,检测多重PCR方法的特异性和敏感性。利用建立的多重PCR方法检测42株禽致病性大肠杆菌的耐药基因,同时,检测其耐药性,比较分析耐药基因和耐药表型之间的相关性。结果显示,建立的4组多重PCR体系可有效扩增出17个耐药基因片段,测序结果表明特异性较好。敏感性结果表明,4组多重PCR体系的菌液敏感性分别为103、104、104和105CFU。禽致病性大肠杆菌分离株的耐药基因多重PCR和单重PCR检测结果一致,其携带的耐药基因和耐药表型的符合率为92.86%。本研究建立的耐药基因多重PCR方法能简便、快速地检测常见的耐药基因,可用于耐药基因的传播、流行调查。 相似文献
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为建立一种快速诊断由猪链球菌(SS)、猪胸膜肺炎放线杆菌(App)、猪多杀性巴氏杆菌(Pm)、副猪嗜血杆菌(Hps)、猪支气管败血波氏杆菌(Bb)和猪肺炎支原体(Mhp)单独或混合感染引起的猪呼吸道疾病的检测方法,基于上述6种病原菌对应的gdh(SS)、apxⅣA(App)、KMT1(Pm)、16S rRNA(Hps)、fla(Bb)和p36 ldh(Mhp)基因设计特异性引物,通过优化各反应条件建立了能同时检测SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp的多重PCR方法。结果显示,该方法特异性强,仅对SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp有特异性扩增,对大肠埃希氏菌、奇异变形杆菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌等其他病原菌的扩增结果均为阴性;敏感性较高,对6种病原菌DNA的最低检出限分别为SS 8.66×102拷贝/μL、App 1.05×104拷贝/μL、Pm 8.61×102拷贝/μL、Hps 9.01×102拷贝/μL、Bb 7.54×102拷贝/μL、Mhp 3.86×10... 相似文献
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为建立检测牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3）3种基因型的多重RT-PCR方法,根据GenBank上发表的BPIV3 3种基因型病毒株的HN基因序列设计特异性引物,优化反应体系建立多重RT-PCR方法。结果显示,方法可同时扩增出BPIV3 A型150 bp、B型253 bp和C型342 bp的特异性片段,与牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）、牛支原体、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀性巴氏杆菌A型和B型均无交叉反应,A、B、C基因型BPIV3最低阳性质粒检测量分别为0.89×104、0.92×104和1.53×104拷贝/μL。本试验建立的多重RT-PCR检测方法操作方便、特异性强,应用于临床样本的检测,可快速检测BPIV3 3种基因型。 相似文献
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牛纽布病毒(bovine nebovirus, BNeV)是国内近几年发现的引起犊牛腹泻的新病原，为了建立快速、准确且能定量分析BNeV的检测方法，本试验根据GenBank上发布的BNeV聚合酶基因(RdRp)序列设计合成了1对特异性引物和1条探针，并通过优化反应体系，成功建立了BNeV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并对临床样品进行检测。结果表示，该方法最佳上下游引物浓度均为500 nmol/L,探针浓度为400 nmol/L,在1×108～1×101拷贝/μL之间呈现良好的线性关系，线性相关系数R2=0.996,扩增效率为105.9%;该方法特异性较强，在多个犊牛腹泻相关病原中，只检测出BNeV;敏感性较高，对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×101拷贝/μL,而普通PCR对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×103拷贝/μL;重复性较好，组内变异系数和组间变异系数均小于3%;对2021年3-5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BNeV的检出率为35.1%,... 相似文献
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《中国兽医学报》2020,(2):303-310
为研究鸽源奇异变形杆菌中磷霉素耐药基因fosA3的流行与传播特征,从广东省佛山市某鸽场采集鸽子及环境样品72份,采用选择性培养基及MALDI-TOF-MS分离鉴定奇异变形杆菌。采用PCR检测质粒介导磷霉素耐药基因fosA3、fosC2以及fosA,采用微量肉汤稀释法测定阳性菌株耐药表型。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、全基因组测序以及构建核心基因组进化树分析菌株的亲缘关系。采用接合转移、Southern杂交及PCR-mapping方法探究fosA3的分子传播特征。结果显示,72份样品中共获得22株奇异变形杆菌,16株菌中检出fosA3,没有检出fosC2和fosA。fosA3阳性菌株均对磷霉素表现高水平耐药(MIC>256 mg/L),对受试9种抗菌药物耐药,呈现多重耐药表型。16株fosA3阳性菌株主要分为2种不同PFGE谱型,随机挑选2株代表性菌株进行全基因组测序并进行遗传进化树分析,发现其中1株fosA3阳性菌与数据库中1株人源奇异变形杆菌之间亲缘关系最近。16株阳性菌株中fosA3均位于染色体上,不能发生接合转移。有阳性菌株中均检测到IS26-orf3-Δorf2-orf1-fosA3-IS26的遗传结构。本研究鸽场奇异变形杆菌中染色体编码的fosA3存在较高的流行性,该基因主要通过菌株的克隆传播以及插入元件IS26介导的水平转移进行传播,应引起高度重视。 相似文献
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PEDV、TGEV和PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪轮状病毒（PRoV）的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDV N基因、TGEV M基因和PRoV VP6基因。经优化反应条件,成功建立了能同时检测并区分PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法可特异扩增PEDV、TGEV、PRoV相应的基因片段,而与猪瘟病毒（CSFV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）均无交叉反应;对PEDV、TGEV、PRoV基因重组质粒标准品的检出限分别为1.41×103、1.41×102和1.41×103拷贝/μL;在相同条件下重复试验可获得一致的结果。应用该方法对临床采集的190份腹泻病料进行检测,结果PEDV阳性42份,阳性率22.11%;TGEV阳性58份,阳性率30.53%;PRoV阳性34份,阳性率17.89%,且存在不同病毒混合感染的现象。结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于PEDV、TGEV和PRoV的临床检测和流行病学调查。 相似文献
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为建立一种特异性强且敏感性高的兔源A型多杀性巴氏杆菌快速检测方法，本研究以兔源A型多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD基因为目的基因，设计2对特异性引物进行双重PCR扩增，经反应条件优化，建立检测兔源A型多杀性巴氏杆菌的双重PCR方法。该方法的最佳退火温度为57.8℃，最佳混合引物浓度为0.8μmol/L。该方法特异性强，对兔源A型多杀性巴氏杆菌为kmt1和hyaD基因双阳性，对兔源D型和F型多杀性巴氏杆菌为kmt1基因单阳性，对兔源其它细菌性病原和阴性对照则均为阴性。该方法敏感性高，对兔源A型多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD基因的最低检出限分别为1×103拷贝/μL和1×104拷贝/μL。该方法重复性好，且与已报道的多重PCR方法的符合率高达96.12%。本研究建立的双重PCR方法对兔源A型多杀性巴氏杆菌具有良好的特异性和敏感性，且重复性好、准确性高，为该病原的快速检测提供了有力的技术支持。 相似文献
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术（RPA）,针对ASFV B646L （p72）基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,该方法在39℃、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应,检测5.5×106至5.5×100拷贝/μL共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38%~28.30%。该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为中国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。 相似文献
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为建立检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，本试验参考GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)M基因、猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)VP1基因、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N基因和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)N基因的序列，分别设计相应的引物，构建4种病毒的阳性质粒。以阳性质粒为标准品，通过优化反应条件和反应程序，建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，并确定了该检测方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示，该方法具有较高的灵敏性，对PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的最低检测量分别为1.37×102,1.44×102,1.51×102和1.56×102拷贝/μL。而扩增猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)、猪瘟病... 相似文献
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为检测牛传染性鼻气管炎病毒,通过设计针对gB基因的特异性引物扩增gB基因,构建阳性重组质粒。经过优化建立了牛传染性鼻气管炎病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测方法在阳性标准质粒拷贝数在5.474×104～5.474×109拷贝/μL时线性关系良好,线性相关系数R2=0.999 3。该方法最低检测限为5.747×102拷贝/μL;可以特异性检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒(BPIV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)不发生交叉反应。病毒滴度与拷贝数的线性关系良好,线性相关系数R2=0.985 4。该方法为牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测提供了技术支持。 相似文献
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为建立一种简便、快速的针对非洲猪瘟病毒(ASFV)多基因家族成员MGF360-12L的分子检测方法,基于MGF360-12L基因序列,设计并合成引物,建立重组酶聚合酶扩增(RPA)等温检测方法。结果表明,于35℃恒温反应30 min,即可实现对目的片段的稳定扩增;以含有MGF360-12L基因的重组质粒为模板,RPA反应的检测限达到10~3个拷贝,同普通PCR方法检测限一致;此外,该RPA方法仅特异性扩增非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因,对PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV 和 PCV-2基因组cDNA或DNA没有扩增。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低,能够为ASFV相关基因缺失毒株的鉴别诊断提供一定技术支持。 相似文献
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为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同) PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并采用该引物经PCR扩增PirB基因片段,构建重组质粒p MD18-T-PirB并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品进行q PCR扩增,建立标准曲线,并经反应条件优化初步建立了检测该类VpAHPND的SYBR Green I q PCR方法。以白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫及该VpAHPND的基因组DNA为模板,采用本研究建立的SYBR Green I q PCR方法检测,评估该方法的特异性;以8.3×101拷贝/μL～8.3×108拷贝/μL的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的SYBR Green I ... 相似文献
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本研究旨在建立一种特异、灵敏、快速的ASFV-G-ΔI177L实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法。针对ASFV I117L基因的保守区域设计特异性引物/探针对，通过优化反应条件和反应程序，从而提高检测方法的灵敏性，并验证检测方法的重复性和特异性。对170份临床样品进行了检测，并与OIE推荐的检测方法进行对比。结果表明，基于ASFV I117L基因所设计的特异性引物/探针对，能扩增2.2×101～2.2×1010copies·μL-1的pMD18-I177L标准质粒，建立的标准曲线R2可达0.995 7,最低检测模板浓度为2.2×101copies·μL-1;该方法扩增反应采用一步法，耗时35 min,批内、批间变异系数均<1.8%;针对ASFV I177L基因特异性扩增，但对其他5种常见猪病毒核酸样品及无酶水未见阳性扩增；用该方法对170份临床样品进行检测，本方法和OIE推荐的检测方法具有良好的一致性。本研究成功建立了一种特异、灵敏、快速AS... 相似文献
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以4个代表性海雀稗（Paspalum vaginatum）种质的叶片DNA为模板,采用L9（34）正交试验设计,对影响海雀稗SRAP-PCR反应的Mg2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶的用量进行了优化,并比较了不同浓度模板DNA对扩增的影响,以确定适合海雀稗的SRAP-PCR最佳反应体系。结果表明：海雀稗SRAP-PCR最佳反应体系为10×PCR buffer 1 μL、模板DNA50 ng、Mg2+2.5 mmol·L-1、dNTP150 μmol·L-1、引物0.4 μmol·L-1、TaqDNA聚合酶1.0 U,总体积10 μL。利用该反应体系从100对引物中筛选出可扩增清晰条带的引物83对,在83对引物中选出多态性丰富的引物44对。SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选,为今后利用SRAP标记技术进行海雀稗遗传多样性研究、基因定位、遗传图谱的构建以及分子标记辅助育种提供技术支持。 相似文献
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试验旨在建立一种简单、快速检测猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）的重组酶聚合酶（recombinase polymerase amplification,RPA）检测方法,为中国PPV的防控和诊断提供一种新的、可靠的技术支持。本研究基于PPV VP2基因的保守序列,设计合成1对RPA引物探针,通过对反应时间的优化,建立38℃恒温水浴锅检测PPV的RPA方法。结果表明,所建立的RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应30 min,能够特异性的检测PPV;以重组质粒pPPV-VP2作为模板,RPA的检测限为102拷贝,同本研究中应用的实时荧光定量PCR方法检测限一致,比普通PCR方法高100倍;RPA方法对疑似PPV感染临床样品的阳性检出率为82.6%,略低于实时荧光定量PCR的检出率（86.9%）,明显高于普通PCR的阳性检出率（66.7%）。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速,结果确实可靠,适用于PPV的快速检测。 相似文献
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牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)和阿卡斑病毒(Akabane virus, AKAV)是引起牛发生繁殖障碍性传染病的主要病原。本研究根据BVDV的5′-UTR、IBRV的gB基因和AKAV的S基因设计了3对特异性引物,构建了检测BVDV、IBRV和AKAV的多重PCR方法,并优化反应体系和条件,验证了该方法的特异性和敏感性。结果显示,构建的多重PCR方法对其他牛源病毒无扩增,对BVDV、IBRV和AKAV的最低检测限分别为103、103和104 拷贝/μL。对采集的184份临床血清样品进行检测,BVDV、IBRV和AKAV的阳性率分别为18.48%、14.13%和1.63%,BVDV和IBRV 2种病原混合感染的阳性率为3.8%,BVDV和AKAV两种病原混合感染的阳性率为1.63%。该结果与我国出入境检疫行业标准符合率达92%以上,BVDV+IBRV和... 相似文献
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为建立禽偏肺病毒(aMPV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法，本研究以aMPV F基因为靶基因，根据其保守区域设计特异性引物和探针，通过各反应条件的优化，初步建立检测aMPV的dd PCR方法。反应条件优化结果显示，最佳引物终浓度1μmol/μL，探针终浓度0.5μmol/μL，退火温度56℃。绘制的标准曲线显示，重组质粒标准品稀释倍数的对数与相应质粒检出拷贝数的对数呈良好的线性关系(R2=0.999 8)。采用该方法同时检测aMPV、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和禽腺病毒，结果显示，仅aMPV检测为阳性，其他病原均为阴性。特异性较强。将p MD18-aMPV重组质粒标准品10倍倍比稀释(105～109,4.3×103拷贝/μL～4.3×10-1拷贝/μL)后作为模板，采用该方法检测，结果显示该方法对重组质粒标准品的检测限为4.3拷贝/μL，比荧光定量PCR (qPCR)检测限(43拷贝/μL)敏感。对3个稀释度质粒标准品... 相似文献