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1.
应用Gibson Assembly连接法精确快速构建狂犬病病毒SRV9株重组感染性cDNA克隆,为狂犬病病毒感染性cDNA克隆的构建提供新的方法。应用Gibson Assembly连接法在同一反应体系内,将多个片段和经限制性内切酶线性化的载体,按设计的顺序进行连接,实现多个片段的一步组装。设计带有20bp~30bp重叠序列的PCR引物,扩增得到带有重叠序列的狂犬病病毒5个结构蛋白基因和增强型荧光蛋白基因。扩增的片段和线性化的载体经胶回收纯化后,与Gibson连接液混合后,50℃反应60min,连接产物转化Stbl3感受态细胞,提取重组质粒,经PCR、酶切和测序鉴定,缺失了病毒伪基因Ψ区和糖蛋白基因的跨膜区并且将增强型荧光蛋白基因插入糖蛋白基因终止密码子前,构建了全长17 600bp的重组质粒,完成了重组全长感染性cDNA克隆的构建。 相似文献
2.
应用反向遗传技术对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株感染性克隆PBRN-FL质粒进行操作,构建插入欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5基因的重组质粒LaSota-ORF5并进行病毒拯救及鉴定。依据GenBank所发表的欧洲型PRRSV LV株ORF5序列,设计引物扩增ORF5片段,通过PBRN-FL质粒上P和M基因间的PmeⅠ酶切位点插入目的片段,构建重组质粒LaSota-ORF5。采用磷酸钙转染法将重组质粒和PCI-NP、PCI-P、PCI-L等3种辅助质粒共转染BSR-T7/5/细胞拯救病毒并对其分别进行RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)和Western blot(WB)试验鉴定。结果显示:拯救病毒的RT-PCR产物测序结果正确,IFA出现绿色荧光,WB试验条带大小符合预期,证明GP5蛋白有效表达。结果表明:成功构建并拯救得到重组病毒rLaSota-GP5,为制备表达PRRSV GP5蛋白的重组NDV疫苗奠定基础。 相似文献
3.
【目的】为探明引起禽白血病病毒K亚型(ALV-K)两不同毒株之间致瘤性差异的原因,进一步探索ALV-K的致病机理,实现两株ALV-K重组病毒感染性克隆的构建及病毒拯救。【方法】以前期构建的ALV-K毒株HB2018003和HB2015032的感染性克隆为模板,PCR扩增分别获取两毒株单独的5'-端长末端重复序列(5'-LTR)基因片段和剩余目的基因片段。切胶回收目的片段后将两毒株的5'-LTR互换,通过同源重组的方法获得连接产物。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后涂布Amp抗性平板过夜培养,挑取PCR鉴定为阳性的菌落提取重组质粒TOPO-003-032和TOPO-032-003并送检测序。将PCR和测序鉴定正确的重组质粒转染至易感细胞DF-1中盲传3代,使用群特异性抗原P27 ELISA、多重 PCR和间接免疫荧光等方法对拯救的病毒进行检测。【结果】测序和重组感染性克隆PCR鉴定的结果表明成功构建了5'-LTR互换的重组质粒,多重PCR结果显示在目的片段大小处出现ALV-K预期条带,未出现ALV-A和ALV-J条带,间接免疫荧光试验结果显示接种拯救病毒的DF-1细胞出现明显的亮绿荧光,阴性对照则没有出现荧光。综合以上结果,说明两株重组病毒拯救成功,并将其分别命名为rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。【结论】本研究采用同源重组的方法构建了5'-LTR互换的感染性克隆TOPO-003-032和TOPO-032-003,并成功拯救出病毒rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。 相似文献
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为研制预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗候选毒株，本研究依据HP-PRRSV HuN4毒株GP5基因序列设计并合成1对特异引物，BamHⅠ引入到引物的5′端，从HP-PRRSV毒株的RNA中，用RT-PCR扩增HP-PRRSV GP5基因。将BamHⅠ酶切的PCR产物与同样酶切并去磷酸化的PRV转移载体pG相连接，构建重组质粒pG-GP5/HP-EGFP。采用脂质体转染法将pG-GP5/HP-EGFP质粒转染已接种PRV三基因缺失毒株rPRV-gE-/gI-/TK-的ST细胞中，经病毒空斑纯化，获得携有HP-PRRSV GP5基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因的重组伪狂犬病病毒rPRV-GP5/HP-EGFP。将重组病毒rPRV-GP5/HP-EGFP接种CRISPR/Cas9 EGFP敲除质粒转染过的ST细胞，经4轮病毒空斑纯化，最终获得无绿色荧光蛋白的重组病毒rPRV-GP5/HP。经PCR鉴定及测序，证实获得的rPRV-GP5/HP在EGFP基... 相似文献
6.
《畜牧兽医学报》2015,(11)
旨在建立一种针对狂犬病病毒SAD L16株单质粒拯救的反向遗传操作系统。根据全长cDNA感染性克隆pSAD-L16 N、P和L基因上游序列的不同,分别设计多对引物将EMCVIRES序列、PV IRES序列和TaV 2A序列分别克隆入pSAD-L16载体的相应位置中,构建成5个重组狂犬病病毒全长cDNA克隆。在无需辅助质粒的情况下直接转染BSR T7/5细胞拯救病毒,并对拯救病毒进行生物学特性的鉴定和分析。结果表明,只有pSADNeNePeL和pSAD-NeNtPeL能够成功拯救出重组狂犬病病毒,获救病毒均高度致弱且增殖缓慢。获救的2株重组狂犬病病毒具有不同的遗传稳定性,表现出与野生型亲本毒株较大的差异。本研究首次建立起一种针对狂犬病病毒的单质粒拯救系统,为深入研究狂犬病病毒基因组结构与功能、分子致病机制以及狂犬病病毒与宿主相互作用等提供了一个基础的技术平台。 相似文献
8.
O型口蹄疫病毒O/LZ株拯救 总被引：1，自引：0，他引：1
以构建的口蹄疫病毒O／LZ株全长cDNA为模板,使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录,得到病毒RNA。用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK细胞,可观察到典型的口蹄疫病毒致细胞病变效应。对收获的病毒分别用RT—PCR、免疫荧光以及免疫电子显微镜观察等方法进行鉴定,结果表明拯救到特定的口蹄疫病毒。同时用空斑试验法观察了拯救病毒及其母本毒株的生长特性,结果表明二者没有明显差异,这将为进一步探索猪口蹄疫病毒致病的分子机制及研制新型口蹄疫疫苗奠定良好的基础。 相似文献
9.
塞内卡病毒A（SVA）与口蹄疫病毒（FMDV）引起猪的临床症状难以区分,并且以SVA作为载体插入FMDV抗原表位外源基因的研究,目前还没有报道。为了构建一种嵌合FMDV抗原表位的重组SVA毒株并进行鉴定,本研究利用基因克隆技术将O型FMDV的B细胞表位与白蛋白信号肽（human albumin signal peptide,HAS）基因串联插入到SVA基因组中,成功构建了重组质粒,转染细胞后拯救出重组病毒rSVA-HAS-OB。结果显示：RT-PCR扩增与基因测序结果表明目的基因正确插入;细胞间接免疫荧光和Western blot鉴定了嵌合抗原蛋白的有效表达;遗传稳定性分析表明重组病毒在25代次的传代过程中仍稳定存在B细胞表位;病毒蚀斑表型和一步生长曲线结果表明,重组病毒与亲本毒株具有相似的增殖特性。本研究成功构建并拯救出能够表达FMDV抗原表位的重组SVA毒株,为以SVA为基础的嵌合病毒及疫苗的研究提供了理论和实验基础。 相似文献
10.
为研究Nsp2编码区不同区域缺失对病毒体外复制的影响,本研究在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)XH-GD株反向遗传操作平台的基础上构建了pOK-AaBCD、pOK-AbBCD、pOK-AcBCD等3种Nsp2编码区部分缺失的感染性重组质粒。将这3种感染性质粒分别转染Marc-145细胞进行不同Nsp2缺失株的病毒拯救,结果显示,只有在Nsp2编码区缺失105个氨基酸的缺失株XH-GD-Δ105能够在Marc-145细胞中增殖,表明这一缺失区域为病毒复制的非必需,而其他两种感染性质粒则未拯救出相应的缺失重组病毒。本研究为进一步研究Nsp2的基因序列的缺失与PRRSV毒力之间的关系奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2014,(12):1883-1887
通过敲除痘苗病毒天坛株(vaccinia virus tiantan strain,VTT)复制非必需基因TA35R,结合双筛选标记及同源重组技术,构建TA35R基因缺失的VTT弱毒株rVTT-TA35R-。人工合成含有TA35R重组臂、同向loxp序列、早晚期启动子PE/L、EGFP及酶切位点的穿梭质粒pTA35R-EGFP。pTA35R-EGFP和野生型VTT共转染BHK-21细胞,通过绿色荧光蚀斑筛选,构建缺失TA35R基因且含FGFP基因的重组痘苗病毒rVTT-TA35R--EGFP+。采用Cre/Loxp系统敲除外源筛选标记EGFP,获得缺失TA35R基因的重组痘苗病毒rVTT-TA35R-,利用PCR方法和电子显微镜对其进行鉴定,通过MTT法检测细胞噬性以评价其减毒效果。结果表明,所构建的痘苗病毒弱毒株rVTT-TA35R-完全缺失了TA35R基因和外源筛选标记EGFP,且细胞毒性减弱。 相似文献
12.
A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原，与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构，所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗，用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫，以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础，在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因，经双酶切及测序鉴定，成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞，拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示，该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明，重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性，插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。 相似文献
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为了在Sf9昆虫细胞中表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白，试验以PCV-2毒株(PCV-2b)的DNA为模板扩增ORF1基因，将ORF1基因插入到转移载体质粒pQB3s上，构建重组质粒pQB3s-PCV-2b-Rep,将重组质粒与杆状病毒表达载体qBac-ⅢG共同转染Sf9昆虫细胞，获得P0代重组杆状病毒，经连续传代获得P1、P2、P3代重组杆状病毒，将P3代重组杆状病毒接种到Sf9昆虫细胞中进行悬浮培养，收集细胞并利用镍柱纯化重组表达的蛋白，通过荧光显微镜观察感染重组杆状病毒的Sf9昆虫细胞中的荧光量，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果表明：经PCR鉴定在945 bp处出现特异性条带；通过荧光显微镜观察，在转染后第1天就出现绿色荧光，第4～5天出现大量绿色荧光，P2、P3代重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞及P3代重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞后在第4～5天出现大量绿色荧光；P2、P3代重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞的细胞裂解液及纯化的重组Rep蛋白，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定在约38 ku处出现... 相似文献
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为了研究山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响,同源重组构建TK基因缺失型重组山羊痘病毒,检测其增殖特性。试验在通用转移质粒pTKfpgigp内插入不同长度的X1~X4片段,构建了4个重组转移质粒;重组质粒转染已感染山羊痘病毒的羔羊睾丸细胞,经同源重组产生4株TK基因缺失型重组山羊痘病毒rGPV/tk－,其TK基因内分别插入了长度约为2 800、4 000、5 200、7 700 bp的外源DNA片段;筛选纯化重组毒株,测定rGPV/tk－病毒滴度。结果显示,TK基因失活后,rGPV/tk－病毒滴度明显降低;随着插入DNA片段的延长,重组毒株的病毒滴度下降程度更加明显。研究表明,TK基因功能的缺失对山羊痘病毒的增殖具有一定的抑制作用,并与外源DNA的长度具有相关性。 相似文献
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利用同源重组技术,通过一步法快速构建A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)感染性克隆平台,从而为研究其致病机理、构建标记疫苗等奠定基础。依次扩增CMV启动子、SVA全基因组、poly(A)尾巴及丁肝核酶序列(HDVr),利用同源重组技术,将3段核酸片段整合进低拷贝载体pWSK-29。将菌落PCR鉴定正确的感染性克隆质粒(pWSK-29-SVA)转染BHK-21细胞,拯救病毒,在盲传第5代时对拯救病毒进行基因测序鉴定,并对其进行生物学特性分析。结果显示:成功构建了SVA感染性克隆质粒(pWSK-29-SVA),成功拯救了病毒,将拯救病毒命名为rSVA(rescued SVA);rSVA测序结果与亲本病毒高度同源,且二者生物学特性相似。结果表明,本试验经同源重组法一步构建pWSK-29-SVA感染性克隆平台,避免了传统感染性克隆中酶切、连接及寻找酶切位点带来的繁琐与不便,构建方案更为灵活多样,大大提高了便利性与实效性,且拯救出的病毒生物学特性与亲本毒株高度一致。本研究为进一步研究SVA致病机理、构建疫苗提供了平台。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(2)
为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型口蹄疫(FMD)的标记疫苗储备病毒株,本研究通过化学合成东南亚地区流行的A型口蹄疫疫毒(FMDV)A/VN/03/2009株的P1基因,将其插入含FMDV编码非结构蛋白3A aa91-aa105位缺失的O/HN/93病毒全长重组质粒p OFS/3A_(91-105)中,构建FMDV A型和O型嵌合的全长重组质粒p O/3A_(91-105)-AP1。该重组质粒经NotⅠ酶切线性化后转染于表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞中,拯救得到FMDV重组病毒。间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明拯救的FMDV为正确的A型和O型间嵌合及3A aa91-aa105缺失的重组病毒。病毒蚀斑和一步生长曲线表明拯救病毒的感染性和复制能力稍低于其亲本病毒。该型间嵌合标记病毒的成功拯救为研制防控边境地区A型FMD的储备疫苗奠定了基础。 相似文献
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为构建禽网状内皮组织增生症病毒(REV)MD-2株的感染性克隆,将MD-2株的前病毒基因组全长克隆至pMD18-T Simple载体中构建MD-2全长质粒,经转染CEF细胞后进行病毒拯救及鉴定,并对拯救病毒进行了生物学特性研究。结果表明,成功构建了MD-2全长质粒,拯救病毒感染CEF细胞后用间接免疫荧光试验检测到病毒抗原;拯救病毒的生长特性与亲本病毒相比无明显差异。随后对env基因进行了多个位点的定点突变,并拯救出相应的突变株,结果显示env基因第1433位碱基突变后不能拯救出病毒,推断1433位的突变为致死性突变。MD-2株感染性克隆的构建和病毒拯救的研究为继续研究REV基因和蛋白功能提供了技术支持。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2015,(9)
为建立猪脑心肌炎病毒(EMCV)HB10株cDNA感染性克隆,本研究利用反向遗传操作技术,采用RT-PCR一次性扩增EMCV-HB10株全长基因组(包括5'和3'UTR)序列,并直接克隆于低拷贝载体pOK12中,构建了EMCV感染性重组质粒pOK12-EMCV-HB10。将重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞进行病毒拯救。结果显示,转染细胞36 h后,出现典型的细胞病变。拯救病毒rEMCV-HB10全基因组经测序鉴定显示,与亲本病毒开放阅读框比较,其仅在1D基因出现两个核苷酸突变:即A37G(R13K)和G187C(M63I),该突变可以作为区别亲本病毒的标志。间接免疫荧光和生长曲线试验结果显示,这两个突变并不影响VP1蛋白的表达及病毒拯救,并且拯救病毒与亲本病毒具有相似的生长特性。本研究构建了感染性EMCV-HB10 cDNA克隆,为深入研究EMCV的致病分子机理提供了有效的反向遗传操作平台。 相似文献
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《中国兽医学报》2018,(12)
探究犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒的拯救及鉴定,为后期犬瘟热-狂犬病二联口服弱毒活疫苗的研制奠定基础。采用脂质体转染的方法,将纯化后的重组质粒(pcDNA-N-G-EGFP-CDVN-PM-L)与辅助性表达质粒(pcDNAN、pcDNA-G、pcDNA-P、pcDNA-L)共转染BSR细胞,通过RT-PCR和间接免疫荧光技术进行检测并鉴定。结果显示,对盲传至第6代、第9代病毒液进行RT-PCR检测,均出现与预期相符的目的片段(狂犬病病毒N基因片段大小为1 315bp,犬瘟热病毒CDV-N基因片段大小为1 653bp)。间接免疫荧光试验后在激光共聚焦显微镜下,试验组均可观察到大量绿色荧光表达。RT-PCR结果与间接免疫荧光试验结果相吻合,表明犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒拯救成功。 相似文献