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1.
为建立一种适用于现场快速检测的猪流行性腹泻病毒(PEDV)LAMP技术,基于羟基萘酚蓝(HNB)的可视化显色特点,根据PEDV M基因编码区序列,设计合成1套引物,通过反应物浓度和反应条件优化,建立了可闭管检测的PEDV RT-LAMP检测方法。特异性和灵敏度试验结果显示,建立的RT-LAMP检测技术快速、灵敏、特异,可于1 h内检出0.2 mL 0.1 TCID50/mL的病毒RNA,与实时荧光RT-PCR检测方法灵敏度一致,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪链球菌2型核酸不发生交叉反应。利用该方法对187份送检的粪拭子及病死猪组织样品进行应用检测,检出阳性样品9份,与荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。试验结果表明,所建立的方法快速、特异,重复性满足要求,适用于送检样品的PEDV快速检测。 相似文献
2.
《中国预防兽医学报》2021,(8)
为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,本研究以PEDV N基因的保守序列为靶基因设计引物,优化并建立了基于RT-LAMP的PEDV快速检测方法。结果显示,RT-LAMP方法的最佳反应条件为:反应温度为61℃,反应时间为50 min,Mg~(2+)和dNTPs浓度分别为8.0 mmol/L和4.0 mmol/L,外引物和内引物最佳浓度比为1.4。特异性试验结果显示,该方法只能检测出PEDV,对其他病原检测均为阴性,具有良好的特异性;敏感性试验结果显示,该方法能够检测出的最低RNA浓度为6.52×10~(-5)mg/L,而常规RT-PCR能检测到最低浓度为6.52×10~(-3)mg/L,表明RT-LAMP敏感性是RT-PCR的100倍;重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验结果无明显差异,重复性较好。利用RT-LAMP和RT-PCR方法分别对3份已知阳性样品,5份已知阴性样品以及52份未知临床样品进行检测。阳性样品经RT-LAMP和RT-PCR方法均检测到PEDV,阴性样品均未检测到PEDV。52份临床样品中,RT-LAMP对PEDV检测阳性率为23.08%(12/52);RT-PCR检测阳性率为17.31%(9/52),二者的符合率为94.23%。以上结果表明,建立的RT-LAMP方法具有成本低、检测快、灵敏度高、特异性强等优点。且结果易于判定、便于现场检测,在病原检测方面具有良好的应用前景,为该病的流行病学调查及综合防制提供重要的实验依据。 相似文献
3.
《畜牧与兽医》2021,(5)
旨在建立一种适用于现场快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的可视化环介导等温扩增(LAMP)方法。采用针对非洲猪瘟病毒的p72基因编码区序列,设计合成2组引物,对引物进行筛选和反应条件优化,确定敏感性与特异性,并与荧光定量PCR方法进行比较。结果:建立的LAMP方法在63℃50 min内对ASFV的检测灵敏度为10 copies/μL,与猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)均无交叉反应;利用该方法对300份送检的临床样品进行检测,检出阳性样品8份,与荧光定量PCR检测结果一致。综上表明,本研究建立的方法具有特异性好、灵敏度高、快速、结果可视、设备适用范围广等优点,适用于ASFV现场快速检测。 相似文献
4.
《中国畜牧兽医文摘》2016,(1)
本试验旨在建立能同时检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的二重RT-PCR检测方法。首先根据Gen Bank收录的TGEV和PEDV的基因序列,设计扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的特异性引物,然后通过优化二重PCR的体系建立一个二重RT-PCR检测方法。用该方法对临床收集的10份粪便样品进行检测,初步表明本研究建立的二重PCR方法具有良好的特异性和灵敏度,能用于临床诊断及流行病学调查。 相似文献
5.
为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的TGEV核蛋白(N)基因和PEDV膜蛋白(M)基因保守区域序列分别设计了1对特异性引物,以TGEV和PEDV混合总RNA为反转录模板,建立了TGEV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了应用检测,并对检测到的阳性样品进行克隆测序。结果表明,成功建立了TGEV和PEDV二重RT-PCR检测方法,该方法的检测灵敏度最低极限为10 TCID50/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增TGEV和PEDV细胞培养物,但对ST细胞和其他7种病原对照扩增不出任何条带;对22份临床疑似TGEV和PEDV感染样品检测结果与测序结果完全一致。本研究成功建立了TGEV与PEDV二重RT-PCR检测方法,可适用于猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病的快速鉴别诊断。 相似文献
6.
为建立一种快速、灵敏、方便的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)早期诊断方法,本研究针对PEDV的M基因片段设计了4条引物,对反应体系的时间、温度进行了优化,对试验的特异性和敏感性进行了评估,初步建立了逆转录环介导恒温扩增技术(RT-LAMP)。结果表明,建立的PEDV RT-LAMP方法在65℃恒温下扩增60min,可通过琼脂糖凝胶电泳或SYBR Green I染料肉眼判断结果,灵敏性较普通RT-PCR高100倍。该方法与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)等无交叉反应,具有良好的特异性。采用该RT-LAMP对100份临床疑似发病粪便拭子、小肠组织、初乳样本进行检测,结果较RT-PCR更灵敏。因此,本研究初步建立了可用于临床PEDV检测的RT-LAMP检测方法,为PEDV的临床快速诊断和综合防控提供了一种新的手段。 相似文献
7.
猪流行性腹泻病毒LAMP检测方法的建立及初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
猪流行性腹泻病毒是引起仔猪腹泻死亡的主要病原。为实现对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的快速检测,利用PEDV S基因设计特异性引物,通过优化各种反应条件,建立了检测PEDV的环介导等温扩增快速检测方法(LAMP)。此方法特异性好,敏感度强,将反转录后的病毒c DNA稀释到108倍仍可检出,是PCR方法的100倍。本研究建立的LAMP方法操作简便、灵敏度高、特异性强,为临床PEDV的快速检测和预防奠定基础。 相似文献
8.
为建立一种特异、灵敏、量化、快速的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,设计1对PEDV N基因的特异性引物,建立Eva Green染料的实时荧光定量RT-PCR的检测方法,并对疑似PEDV感染的临床样品进行检测。结果显示,所建立的实时荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R2=0.999;不与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)发生交叉反应,具有较强的特异性;灵敏度比常规RT-PCR方法高100倍;重复性试验的变异系数均小于5%,重复性良好。对43份临床样品进行检测,结果比普通PCR多检出2份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法在特异性、灵敏度和重复性方面都很好,可用于临床PEDV检测。 相似文献
9.
《畜牧与兽医》2017,(2):83-88
为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV野毒株及弱毒疫苗株的ORF3基因序列,在缺失区的两端设计合成1对特异性扩增引物,用以特异性的扩增PEDV ORF3基因片段,根据目的片段大小判断PEDV的毒株类型;通过退火温度等反应条件优化,建立了区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR鉴别检测方法。结果显示:所建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株;PEDV野毒株扩增出234 bp目的片段,PEDV弱毒疫苗株扩增出185 bp目的片段;与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、A群猪轮状病毒(PRo VA)、猪嵴病毒(PKV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪细小病毒(PPV)均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到病毒滴度为1.3×10~3TCID_(50)/mL。利用该方法对采集自广西部分地区93份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV野毒株阳性率为61.29%(57/93),弱毒株阳性率为5.38%(5/93)。结果表明:该RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便,能快速、准确地区分PEDV自然感染野毒株和弱毒疫苗毒株,为猪流行性腹泻的快速诊断及病原分子鉴别检测研究提供了可供借鉴的技术手段。 相似文献
10.
为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验.结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green Ⅰ染色后仅肉眼观察即可判定结果.该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR.该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV. 相似文献
11.
PEDV、TGEV和PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪轮状病毒（PRoV）的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDV N基因、TGEV M基因和PRoV VP6基因。经优化反应条件,成功建立了能同时检测并区分PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法可特异扩增PEDV、TGEV、PRoV相应的基因片段,而与猪瘟病毒（CSFV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）均无交叉反应;对PEDV、TGEV、PRoV基因重组质粒标准品的检出限分别为1.41×103、1.41×102和1.41×103拷贝/μL;在相同条件下重复试验可获得一致的结果。应用该方法对临床采集的190份腹泻病料进行检测,结果PEDV阳性42份,阳性率22.11%;TGEV阳性58份,阳性率30.53%;PRoV阳性34份,阳性率17.89%,且存在不同病毒混合感染的现象。结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于PEDV、TGEV和PRoV的临床检测和流行病学调查。 相似文献
12.
LONG Fei-xiang SHI Kai-chuang ZHANG Zhen YIN Yan-wen CHEN Han-zhong MO Sheng-lan 《中国畜牧兽医》2016,43(10):2518-2526
In this study,a multiplex RT-PCR assay was established to differentially detect porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine rotavirus (PRoV) after optimization of the reaction conditions.Three pairs of primers PEDV-N,TGEV-M and PRoV-VP6 were designed for specifically amplifying PEDV N gene,TGEV M gene and PRoV VP6 gene,respectively.The assay could specifically amplify PEDV,TGEV and PRoV,but not classical swine fever virus (CSFV),porcine foot and mouth disease virus (FMDV),pseudorabies virus (PRV),porcine parvovirus (PPV) and porcine circovirus type 2 (PCV2).The detection limits of PEDV,TGEV and PRoV standard recombinant plasmids were 1.41×103,1.41×102 and 1.41×103 copies/μL,respectively.The repeated reaction under the same conditions obtained uniform results.The assay was used to detect a total number of 190 clinical samples,of which 42 (22.11%) samples were positive for PEDV,58 (30.53%) samples for TGEV and 34 (17.89%) samples for PRoV,and there were mixed infection among these viruses.The results indicated that this multiplex RT-PCR assay had the advantages of sensitivity,specificity and repeatability and provided a useful tool for differential detection and epidemiological investigation of PEDV,TGEV and PRoV. 相似文献
13.
通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437 bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法.该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为104 拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查. 相似文献
14.
Two pairs of primers used to respectively amplify transmissible gastroenteritis virus (TGEV) S gene and porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) M gene were designed to develop a method of differential diagnosis of TGEV and PEDV.The established double PCR could detect S gene of TGEV with the length of 299 bp and M gene of PEDV with the length of 437 bp.Negative results using CSFV,PCV2,PRRSV and PRV as control were obtained.The detection limit of this method was 104 copies/μL.68 clinical samples collected from swine farm were submitted to detect TGEV and PEDV,and the result showed that the established double PCR method with the characteristics of high sensitivity and high specificity could be widely used in clinical diagnosis and epidemiological investigation. 相似文献
15.
猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因RT-LAMP检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)M基因保守序列6个特异性部位设计了 2对引物,建立了PRRSV的环介导逆转录等温检测方法。结果表明,该方法灵敏度比RT-PCR高100倍;全部反应可在1 h内完成并可得到其特有的阶梯状条带,而且猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;在反应体系中添加SYBR GREENⅠ染料后,可通过肉眼观察有无荧光而直接判定结果。该方法灵敏度高、特异性好,可作为猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速诊断方法。 相似文献
16.
LUO Ya-kun LIANG Lin WANG Jing LIU Cun LIU Qi LIU Chang LIN Wen-cheng CUI Shang-jin 《中国畜牧兽医》2017,44(2):344-349
This study was aimed to establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detection of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), and provide a simple, sensitive, accurate and reliable tool for diagnosis of PEDV.The conservative PEDV N gene (GenBank accession number: KT799997) of PEDV was selected as a target to design six specific primers.The reaction system and temperature of LAMP were optimized, and the LAMP method for specific amplification of PEDV was established. Results showed that the PEDV LAMP detection method was established successfully, and it could detect PEDV specifically at 60℃ for 60 min,and the detection limit was 91 copies/μL, which was one hundred-fold higher than conventional RT-PCR method.75 clinical samples were detected by LAMP and PCR, respectively, the coincidence of LAMP and PCR was about 97.3%. All the data suggested that the LAMP assay had strong specificity, high sensitivity, simple operation, low equipment requirement, and was suitable for rapid detection of PEDV clinical samples. 相似文献
17.
试验旨在建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）的环介导等温扩增方法（LAMP）,为诊断PEDV提供简便、敏感、准确可靠的工具。参考GenBank中PEDV基因序列（登录号：KT799997）,针对PEDVN基因设计了6条引物,对所建立的LAMP反应体系、反应温度进行优化,建立可特异性扩增PEDV的LAMP方法。结果显示,本试验成功建立了PEDV LAMP检测方法,在60℃恒温下反应60 min,能特异性地检测PEDV,检测限量为91拷贝/μL,比常规PCR方法的敏感性高100倍。对比75份临床样本的LAMP和常规RT-PCR法检测结果,显示两种方法符合率为97.3%。综上所述,本试验建立的LAMP方法具有特异性强、敏感性高,操作简单,设备要求低的特点,适用于PEDV临床样本的快速检测。 相似文献
18.
为快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪嵴病毒(PKV),根据PEDV的M基因、TGEV的N基因、PoRV的VP6基因和PKV的3D基因序列设计4对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测4种病毒的RT-PCR诊断方法,该方法可特异性扩增这4种病毒的相应片段,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)均无扩增,最低检出量分别为1.33×10^4、1.33×10^3、1.33×10^4、1.33×10^5copies/μL。应用该方法对临床55份猪腹泻样品进行检测,结果检测出14份PEDV、1份PoRV和27份PKV,未检出TGEV,其中PEDV和PKV混合感染9份。上述结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法快速、特异、敏感,可用于以上4种腹泻病毒的临床检测和流行病学调查。 相似文献
19.
猪瘟病毒野毒株RT-LAMP可视化检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究旨在建立一种可视化检测猪瘟病毒(CSFV)野毒株的反转录.环介导等温扩增方法(RT-LAMP).根据CSFV的NS5B基因序列设计一套RT-LAMP引物,以样品的cDNA为模板,利用Bsf DNA聚合酶,在62℃恒温条件下进行扩增,扩增产物中加入sYBR Green I染料直接或在紫外光下观察判定扩增结果.该方法可检测出不同基因型的CSFV厂野毒株,其检出极限为2.5 TCID_(50)的CSFV,与实时荧光定量RT.PCR方法的敏感性相当;特异性试验表明,该方法对猪瘟免化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒以及其它常见猪源病毒均无扩增反应;通过对126份不同样品进行检测比较,该方法与实时荧光定量RT-LAMP检测方法的符合率达100%.与引物.探针能量转移PCR方法的符合率为98.4%.该方法无需特殊仪器,是一种适用于基层的快速、简便的CSFV野毒鉴别检测方法. 相似文献