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1.
表达绿色荧光蛋白的伪狂犬病毒Bartha-K61株TK-突变株的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
提取伪狂犬病毒(PRV)Bartha—K61株基因组DNA为PCR扩增模板，并根据GenBank已发表的PRV Ka—plan株UL区UL25、UL24、UL23、UL22基因序列，选择保守序列设计了两对引物，分别扩增出位于UL23(TK)两侧(含部分TK基因)的可用于同源重组的左臂片段(L)和右臂片段(R)，L包括部分UL25、全部UL24、部分TK，R包括部分TK及部分UL22，L和R的拼接片段中TK基因内部缺失270个核苷酸。将L片段和R片段克隆于pBlueseript M13—载体上，获得pSKLR；再将绿色荧光蛋白载体pEGFP—C1上含GFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插人pSKLR的L片段和R片段之间构成转移载体pSKLRG。提取pSKLRG质粒，经单酶切线性化后用脂质体与PRV Bartha—K61株共转染143TK^-细胞，在细胞培养液中有5—溴脱氧尿嘧啶(BrdU)存在的条件下筛选出表达绿色荧光蛋白的重组PRV Bartha—K61毒株：PRV rBGFP。 相似文献
2.
本试验采用BamHI酶切伪狂犬病病毒 (PRV)Ma株基因组DNA ,电泳回收 3 4kb和4 4kb片段 ,快速克隆了伪狂犬病病毒Ma株BamHI 3 4kb和 4 4kb片段到质粒 pUC1 9中 ,对其进行部分序列测定并与Genebank序列进行同源性分析 ,结果表明BamHI 3 4kb片段包含UL50等基因 ,与Ka株UL50基因同源性为 87% ,BamHI 4 4kb片段包含RSP40及PK等基因片段 ,与Ka株RSP40基因同源性为 98%。Ka株BamHI 3 4kb片段包含TK基因 ,而包含UL50基因的BamHI片段为 7 4kb。结果表明 ,PRVMa株BamHI酶切位点发生了漂移 相似文献
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伪狂犬病病毒上海株gE基因克隆及其含GFP基因质粒载体的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
根据已发表的伪狂犬病病毒（PRV）gE基因序列设计1对引物，用PCR法扩增了PRV上海株（PRV-SH）的gE基因，并克隆入pUC18中。利用gE基因中限制性酶切位点，把绿色荧光蛋白（GFP）的基因表达盒插入gE基因中，构建了含GFP的载体pUCgE-GFP。 相似文献
5.
将来自质粒pFSV40的300bpBamHI/PstI片段[其中含有SV40poly(A)和部分多克隆位点]插入到质粒pUSK相应的酶切位点中，获得重组质粒USKSV40。该重组质粒中gG基因5’端编码区缺失了428bp。将来自质粒pcDNA3.1( )的946bpBglⅡEcoRI片段（其中含CMV启动子及部分多克隆位点）插入到质粒pUSKSV40的BamHIEcoRI位点，构建了通用载体pPRVCMV-uni，其中含有CMV启动子，SV40poly(A)以及NheI,Pme1,BamHI,BstXI,EcoRI,StuI,XbaI等7个单一克隆位点，将eGFP基因插入到该通用载体的BamHI和EcoRI之间，用所获得的转移载体与TK/gG-/LacZ^ PRV基因组共转染PK-15细胞，经检测eGFP基因在重组伪狂犬病病毒中获得表达，从而证实该通用载体的构建是可行的。本研究研制以伪狂犬病病毒为载体的二价或多价基因工程疫苗奠定了物质基础。 相似文献
7.
伪狂犬病病毒TKˉ/gIˉ株基因组经AscⅠ酶切获得含PK基因的8.7kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ位点,获得中间载体P8-AA,将LacZ表达盒插入其SphⅠ/NdeⅠ位点,构建重组转移载体P8AA-lacZ,将其与伪狂犬病病毒TKˉ/gIˉ株基因组共转染PK-15细胞,细胞出现病变后通过覆盖含有X-gal的营养琼脂进行蓝白斑筛选,通过蚀斑克隆方法分离到重组体PRV（rPRV）,且经过连续传代的rPRV仍能稳定的表达β-半乳糖苷酶活性。通过对重组病毒PRV-LacZ和亲本株TKˉ/gIˉ株TCID50的试验表明,PK基因的缺失对病毒增殖无影响。 相似文献
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新城疫F48E9株L基因克隆与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
本实验根据已知新城疫病毒L基因序列分别设计了两对引物，引物1（L1）、引物2（L2）、引物2（L2）、引物3（L3）、引物4（L4），以L1/L2为引物可以扩出4050bpF48E9株L基因的A片段（LA），以L3/L4为引物可扩增出3504bpE48E9株L基因的B片段（LB）。LA和LB2个片段经特异性双酶切后用T4DNA连接酶连接成完整的F48E9株L基因并克隆到pMD18-T载体中，对克隆后L基因5’端、3’端和连接点处的核苷酸序列进行了测定，经DNASIS软件分析表明为NDVL基因，证明我们获得了F48E9株L基因。 相似文献
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伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
参考Genebank发表的伪犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）的gI和gE基因序列，自行设计并合成了两对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，均呈现一条约960bp和1740bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，进行了序旬测定，将PRV－SH株的gI基因与Rice株gI基因比较发现,核苷酸的同源性为94.7%，氨基酸的同源性为91.3%，证实为gI基因，将PRV－SH gE基因序列与Ea株、Ruce株gE基因序列进行比较，结果显示，该序列与PRV Ea株、Rice株gE基因的同源性分别为98.5%、97.5%；的氨基酸序列与Ea株，Rice株和I型单纯疱疹病毒（HSV－1）17株gE的同源性分别为97.2%、94.8%和15.6%。 相似文献
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表达H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸭瘟病毒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需的TK基因(约1.1kb),将其克隆入pGEM-Teasy载体获得载体pGTK。根据已知的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1的序列设计了一对引物,PCR扩增出pEGFP-C1上含CMV启动子、EGFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入pGTK的TK上,获得质粒pGTK-EGFP。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因序列,设计了两对引物,分别从pT-HA和pT-NA两个质粒上扩增出HA和NA基因,克隆到pGTK-EGFP的表达盒的多克隆位点Kpn2I与SmaI之间,构建含EGFP及HA和NA基因的转移质粒载体pGTK-EGFP-HA-NA。将这质粒载体与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过荧光方法筛选,获得了表达HA和NA基因的重组DPV(rDPV-HA-NA)。 相似文献
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牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株的构建 总被引：8，自引：1，他引：7
将含有牛传染性鼻气管炎病毒（ Ｉ Ｂ Ｒ Ｖ） Ｔ Ｋ 基因的片段克隆于ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ Ｋ 中, 再用 Ｂｇ１ Ⅱ和 Ｓａｃ Ｉ切去 Ｔ Ｋ 基因中３４７ｂｐ 的片段, 获得了含缺失 Ｔ Ｋ 基因的重组质粒, 然后插入 Ｌａｃ Ｚ 报告基因, 构建成转移载体。以脂质体转染法将此转移载体与 Ｉ Ｂ Ｒ Ｖ Ｂａｒｔｈａ 株在牛肾细胞（ Ｍ Ｄ Ｂ Ｋ） 上共转染, 经过蓝色蚀斑筛选和蚀斑克隆纯化, 获得了能稳定遗传的重组 Ｉ Ｂ Ｒ Ｖ。经 Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 印迹杂交鉴定, 证实该重组病毒为 Ｔ Ｋ 基因缺失突变株。 相似文献
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以伪狂犬病病毒SH株细胞培养物为模板，用PCR方法扩增蛋白激酶(PK)基因部分片段，克隆到pCDNA3中，序列测定显示所扩增的PK基因片段长907bp，与PRVNIA-3株的核苷酸同源性为99．6％。把PK基因克隆到pUCl9上，利用PK基因中间的SalI酶切位点，插入带有绿色荧光蛋白(EGFP)的基因表达盒，构成了含EGFP的转移载体，为今后研究PK基因的功能和构建PK缺失株奠定了基础。 相似文献
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伪狂犬病病毒鄂A株TK基因的克隆及其鉴定 总被引：6，自引：0，他引：6
合成了 １ 对能对伪狂犬病病毒（ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ, Ｐ Ｒ Ｖ） Ｔ Ｋ（ｔｈｙｍ ｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）基因＋ １１９～＋ １ ０７１区进行特异扩增的引物,用猪 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株细胞培养物提取的基因组作模板,扩增出 ９５３ ｂｐ 长的片段,用地高辛标记该片段作探针,通过 Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ 杂交,从克隆有 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的重组质粒中钓出含 Ｔ Ｋ 基因的重组质粒 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ。对 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ 进行酶切分析,绘制了含 Ｔ Ｋ 基因的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的图谱,通过测序得出了 Ｔ Ｋ 基因的全序列。将该序列与 Ｐ Ｒ Ｖ Ｎ Ｉ Ａ３ 株 Ｔ Ｋ 基因进行比较,发现鄂 Ａ 株的 Ｔ Ｋ 基因存在变异。 相似文献
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根据已经发表的伪狂犬病病毒(PRV)国内Ea株UL49基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区,并克隆到pMD18-T载体中.重组质粒pMD-UL49经XhoI酶切和PCR鉴定后,进行了序列测定和分析.结果表明,重组质粒pMD-UL49含有PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区.同源性分析显示,PRV Bartha-K61株UL49基因序列与国外Kaplan株、国内Ea株相应基因的核苷酸同源性分别为98.9 %和94.1 %,推导的氨基酸序列同源性分别为96.7 %和87.2 %. 相似文献