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1.
根据已发表的鸭瘟病毒(DPV)TK、dUTPase、PK基因序列,设计合成了3对特异性引物,对DPV GD株的3个基因进行PCR扩增,产物克隆至PTA2载体并进行测序。结果表明,TK基因ORF全长为1 077 bp,编码358个氨基酸;dUTPase基因ORF全长为1 344 bp,编码447个氨基酸;PK基因ORF全长为1 158 bp,编码385个氨基酸。与GenBank上其他DPV毒株的同源基因进行比较,TK基因核苷酸的同源性为99.5%～100%,氨基酸同源性为98.9%～100%;dUTPase基因核苷酸的同源性为99.9%,氨基酸同源性为99.8%;PK基因核苷酸的同源性为99.8%～100%,氨基酸同源性为99.7%～100%。这表明TK、dUTPase、PK基因在DPV基因组中高度保守,为构建DPV基因缺失转移载体奠定了基础。 相似文献
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根据发表的鹅副粘病毒SF02株全基因组序列,分别设计合成一对引物和二对引物,分别采用RT-PCR方法和RT-套式PCR扩增出与预期设计大小相符的F基因和HN基因特异性条带.将扩增出的DNA片段克隆到pMD18-T载体中,转化TGI感受态细胞,经AMP/IPTG/X-Gal平板筛选,酶切鉴定,获得阳性重组质粒.对重组质粒进行序列测定,结果表明:鹅副粘病毒JS/1/97/Go株F基因全长1662bp,编码553个氨基酸残基;F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV的强毒株特征相符.HN基因全长1716bp,编码571个氨基酸残基.将F基因插入到原核表达质粒pGEX-6P-1的EcoR Ⅰ、Xho I多克隆位点之间,转化到TGI感受态细胞中,获得了表达F基因的阳性亚克隆重组质粒;将HN堪因插入原核表达质粒pProEX HTb的XBaⅠ、XhoⅠ多克隆位点之间,转化到TGI感受态细胞中,获得了表达HN基因的阳性亚克隆重组质粒. 相似文献
4.
为构建和表达抗RT单链抗体(ScFv)蛋白,用RT-PCR方法从能分泌特异性抗RT单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因。用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起,构建抗RT-ScFv基因。将ScFv基因连接到pMAL-p2X表达载体,转化TB1表达菌。阳性克隆用IPTG诱导18h,Western blotting鉴定重组蛋白。结果表明,试验成功扩增出了ScFv基因,长度约为750bp。通过DNA序列测定和分析,构建出VL-(Gly4Ser)3-VH。其VH全长363bp,可编码121个氨基酸,VL全长324bp,可编码108个氨基酸。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,抗RT-ScFv在TB1表达菌中获得高效表达,pMAL-p2X表达的ScFv加上同时融合表达的MBP标签分子质量约为75ku。本试验成功构建了pMAL-RT-ScFv表达载体,并获得了高效表达。 相似文献
6.
亚洲璃眼蜱免疫抑制蛋白P36的分子鉴定及重组表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为了解蜱吸血和病原传播的分子机制,本研究从亚洲璃眼蜱唾液腺中克隆获得一个编码免疫抑制蛋白P36的同源性基因,该基因全长924bp,编码区为708bp,预测的编码蛋白包含235个氨基酸,分子量为27ku。BLAST分析表明,该基因预测的氨基酸与美洲花蜱和安氏革蜱唾液腺中的免疫抑制蛋白P36高度同源。RT-PCR分析表明,该基因在未吸血成蜱中没有表达,但吸血后表达。将目的基因与载体pGEX-4T-1连接后转化BL21表达菌,经诱导后得到GST融合重组蛋白。该实验结果为进一步研究P36奠定了基础。 相似文献
7.
黑曲霉3928植酸酶phy基因的克隆及全序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中已注册的黑曲霉基因序列设计了1对引物,通过PCR方法将黑曲霉phy A全基因进行扩增,获得了1条长约1.5 kb的特异性PCR产物,在PMD18 T载体中克隆了黑曲霉3928植酸酶phy A全基因,筛选到2个重组菌落(1#和2#),并进行了全序列测定。序列分析结果表明:2个重组质粒的测序结果完全一致;克隆的片段中含有完整的phy A基因序列,全长1 506 bp,其中含有一段长102 bp的内含子;phyA基因全序列编码467个氨基酸,信号肽位于基因的5′端,长度为19个氨基酸;碱基序列与GenBank中报道的AY513749的同源性为98.87%,编码的氨基酸序列的同源性为97.21%。 相似文献
8.
研究旨在对猪T细胞诱导型刺激物(ICOS)基因的cDNA序列进行克隆与分析。根据已报道的人ICOS基因cDNA序列设计引物,首次从猪脾脏组织总RNA中扩增出ICOS基因编码区全长cDNA序列,克隆于pMD18-T载体后进行测序并进行序列拼接,运用生物信息学分析DNA序列。结果表明:该基因编码区全长630bp,编码210个氨基酸,包含5个外显子。该序列与人全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为80%和85%;与狗和小鼠的推导氨基酸序列的同源性分别为81%和75%。这为进一步研究该基因的结构特点和功能奠定了良好基础。 相似文献
9.
根据GenBank中收录的三种猪Ⅰ型干扰素（porcine interferon,pIFN）基因序列,设计了3对特异性引物。运用RT—PCR技术从长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到了三种猪干扰素基因,并将其克隆至pGEM-T Easy载体上。序列测定结果显示,获得的猪干扰素α1基因序列全长570bp,编码189个氨基酸,获得的猪干扰素α2基因序列全长540bp,编码179个氨基酸,获得的猪干扰素β基因序列全长563bp,编码186个氨基酸。三种猪Ⅰ型干扰素基因与已知猪Ⅰ型干扰素核苷酸序列和氨基酸序列的相似性最高可达99％～100％。 相似文献
10.
《经济动物学报》2015,(3)
采用PCR技术扩增MEV VP2基因,将该基因片段定向克隆原核表达载体PET-30a,构建MEV VP2基因原核表达重组质粒PET-30a-VP2。将该重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDSPAGE和Western-blotting分析。结果表明:该基因全长1 755 bp,其目的基因序列完全正确,能编码584个氨基酸。利用载体上的His标签对其进行纯化,经SDS-PAGE鉴定该重组蛋白以包涵体的形式存在,大小约为70 ku;Western-blotting验证该重组蛋白具有被抗MEV血清识别的特性,具有良好的反应原性,可为MEV基因工程亚单位疫苗、免疫学诊断方法等提供参考。 相似文献
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抗猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体重链基因的克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为获得抗猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体(MAb)重链可变区基因,提取MAb杂交瘤细胞8C4总RNA,通过RT-PCR扩增其重链可变区基因。其DNA序列与GenBank数据库和IMGT/V-QUEST软件比对,序列包含CDR1、CDR2、CDR33个高变区,CDR1含GYTFTSYY 8个氨基酸、CDR2含IYPGDGST 8个氨基酸、CDR3含ARVMIAMDY 9个氨基酸。第22位和96位为骨架区的2个半胱氨酸,形成链内特征性二硫键。该序列符合鼠Ig重链基本框架结构,框架区内无终止密码子,为重排产生的序列。本实验获得的重链序列为研制基因工程抗体奠定了物质基础。 相似文献
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抗口蹄疫病毒单克隆抗体1C7重轻链可变区基因的克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
应用分子生物学技术，从分泌抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1C7中提取总RNA，经反转录，PCR扩增及克隆，分别得到VH基因及VL基因。序列测定结果表明：1C7的VH基因为368bp,VL基因为323bp。用NCBI GenBank分析表明，VH和VL均符合小鼠抗体可变区特征，为功能性重排的抗体可变区基因。根据Kabat分类体系，1C7的VH基因中的VH基因片段隶属于抗体重链第7183家族，其VL基因中的VL基因片段隶属于抗体K轻链20家族，VH基因由VH76－1BG－DFL16．1－JH4重排而形成，VL基因由KVbw20-JK2重排而形成。1C7的VH和VL基因的克隆为抗FMDV scFv的构建与表达奠定了基础。 相似文献
13.
B7-2蛋白为免疫球蛋白超家族(IGSF)成员之一。采用PCR法从分泌鼠抗人B7-2抗体的杂交瘤细胞株克隆出该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,在VH和VL可变区基因间引入连接肽(Gly4Ser)3编码序列,体外构建抗人B7-2的鼠源单链抗体基因B7-2-ScFv。利用新型杂交病毒HyNPV的Bac-to-Bac表达系统,将B7-2-ScFv基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTa中,获得重组转移载体pFastBacHTa-B7-2-ScFv,转化大肠杆菌DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-B7-2-ScFv。将此重组杆粒的DNA转染Sf9细胞,获得重组病毒HyNPV-ScFv。感染该重组病毒的BmN细胞经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,至感染24h时目的蛋白已有表达,96h达到最高表达水平,表达产物的分子质量约31kD。用该重组病毒感染家蚕5龄起蚕,感染后96h蚕体表现出明显的发病症状。RT-PCR结果表明,5龄起蚕感染后48h,在脂肪体内已有目的基因转录,一直持续到感染后120h;SDS-PAGE和Western blotting分析表明,5龄起蚕感染96h后方可在脂肪体中检测到目的蛋白表达。构建并在家蚕中成功表达鼠抗人B7-2单链抗体,为深入研究和开发该抗体奠定了基础。 相似文献
14.
为了构建抗乙肝病毒人源噬菌体特异性单链抗体库,从中筛选抗乙肝病毒人源噬菌体单链抗体库特异性单链抗体,试验提取患者外周淋巴细胞总RNA,以总RNA为模板,通过RT-PCR技术分别扩增出H链和L链可变区基因,采用SOE-PCR方法将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段,然后将ScFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转E.coil TG1,构建抗乙肝病毒人源单链抗体库,并从中筛选阳性克隆抗体。结果表明:经过5轮筛选,获得2株能与乙肝病毒抗原特异性结合的阳性克隆。说明利用噬菌体抗体技术可不经免疫制备抗乙肝病毒人源噬菌体特异性单链抗体。 相似文献
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PRRSV GP5蛋白抗独特型单链抗体的构建表达及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备只包含抗体可变区片段(Fv)的MAb2-5G2单链抗体(scFv),本研究从分泌MAb2-5G2的杂交瘤细胞中提取总RNA,反转录制备cDNA作为模板扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因.以VH-1inker-VL的形式通过重叠PCR制备scFv基因,构建重组表达质粒pEasy-scFv,并在大肠杆菌中获得正确表达.通过western blot和间接免疫荧光鉴定表明scFv蛋白能够被兔抗MAb2-5G2的抗体(Ab3)识别,复性后的scFv蛋白能够特异性结合Marc-145细胞.该研究结果为进一步明确MAb2-5G2结合Marc-145细胞功能区域奠定了物质基础. 相似文献
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利用噬菌体展示技术构建猪流感病毒噬菌体抗体库,并筛选出猪流感高特异性、高亲和力的单链抗体(scFv)。以猪流感病毒免疫BALB/c小鼠,提取脾细胞总RNA,反转录后以cDNA为模板扩增获得VH基因和VL基因,并采用重叠延伸PCR(SOE-PCR),用柔性多肽Linker接头(Gly4Ser)按VH-Linker-VL方式将VH基因和VL基因拼接成scFv基因片段。将scFv基因和pCANTAB5E载体分别双酶切(SfiⅠ/NotⅠ)后连接,转化宿主菌TG1,经过辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体单链抗体库。以猪流感病毒为抗原包被96孔酶标板,经过3轮的亲和富集筛选,用Phage-ELISA鉴定阳性重组抗体。本研究成功构建出库容约为4×106cfu/mL抗猪流感病毒的单链抗体库,并筛选出4株特异性抗猪流感病毒的scFv抗体,能够与鼠源阳性多抗进行竞争结合猪流感病毒,为抗猪流感病毒转基因猪的研究奠定基础。 相似文献
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Réfega S Cluzeaud M Péry P Labbé M Girard-Misguich F 《Veterinary immunology and immunopathology》2004,97(3-4):219-230
Avian coccidiosis is due to a protozoan intracellular parasite belonging to the genus Eimeria which multiplies in the intestine of the host. In order to identify Eimeria antigens which reflect the natural avian humoral immune response, chicken hybridomas were produced by fusion of myeloma MuH1 with B lymphocytes from Eimeria tenella infected chicken. B lymphocytes used for fusions were isolated from tonsils at the basis of caeca where the parasite develops. One of the clones (G1F5) recognised oocyst antigens and the macrogamont stage of the parasite in ELISA and immunofluorescence assay. A single-chain variable fragment (scFv) antibody was cloned from the light chain variant region (VL) and heavy chain variant region (VH) genes of the hybridoma. This recombinant antibody (scFv G1F5) exhibited antigen binding specificity to oocysts and macrogamonts of E. tenella equivalent to the mAb produced by the clone G1F5. Nucleotide sequence analysis of VL genes from scFv G1F5 compared to the germ-line revealed vestiges of gene conversion. scFv derived from chicken B lymphocytes isolated from the gut-associated lymphoid tissue following experimental infection can reveal specific antigens recognised by the avian immune response. 相似文献
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为了获得具有生物学活性的牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV） gD蛋白特异性单链抗体,试验采用PCR方法扩增杂交瘤细胞的cDNA单链抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因,通过重叠延伸PCR及Linker序列获得完整的单链抗体基因,将单链抗体基因克隆至杆状病毒载体pFB-LIC-Bse中,构建重组转移载体pFB-VH-VL,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中制备重组杆粒rBacmid-VH-VL,将重组杆粒rBacmid-VH-VL转染至Sf9细胞中获得携带单链抗体基因的重组杆状病毒。该重组杆状病毒在Sf9细胞中表达了分子质量约为30 ku的单链抗体蛋白。Western blotting结果显示,重组单链抗体蛋白能被His标签抗体特异性结合,也能特异性结合gD蛋白。间接免疫荧光试验结果显示,该单链抗体蛋白能够识别感染牛肾细胞MDBK中的IBRV。本研究在昆虫细胞中成功表达了具有识别IBRV的gD蛋白特异性单链抗体,为牛传染性鼻气管炎的诊断与治疗奠定了基础。 相似文献
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For preparation of bioactive single chain fragment variable (ScFv) which was targeted against envelope glycoprotein D (gD) of infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV),VH and VL genes were amplified from the cDNA of lymphocyte hybridoma, then VH and VL genes were integrated with a Linker by SOE-PCR,and the ScFv gene was cloned into the baculovirus vector pFB-LIC-Bse, which was transformed into Escherichia coli DH10Bac competent cells to construct a recombinant bacmid rBacmid-VH-VL. Finally,ScFv was expressed by transfected rBacmid-VH-VL into insect Sf9 cells, its molecular weight was about 30 ku. The result of Western blotting suggested that ScFv generated in Sf9 cells was specifically binds to His antibody,the protein also showed high affinity to gD of IBRV. The result of indirect immunofluorescence assay showed that ScFv could recognize IBRV which infected bovine kidney cells (MDBK). The study indicated that the recombinant ScFv was expressed in Sf9 cells, and could bind to gD of IBRV specifically. The result could provide the basis for the diagnosis and treatment of infection of IBRV. 相似文献
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Characterization of serum immunoglobulin M of grouper and cDNA cloning of its heavy chain 总被引：4，自引：0，他引：4
Cheng CA John JA Wu MS Lee CY Lin CH Lin CH Chang CY 《Veterinary immunology and immunopathology》2006,109(3-4):255-265
Immunoglobulin M (IgM) from the whole serum of grouper fish, Epinephelus coioides was purified by affinity chromatography using protein A-Sepharose column. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing conditions revealed that the relative molecular masses (Mr) of the equimolar heavy and light chains of IgM were 78,000 and 27,000, respectively. The cDNAs encoding IgM heavy chain comprising its variable (VH) and constant (CH) regions have been cloned and sequenced from a grouper kidney cDNA library by antibody screening method. Five VH (130-142 amino acids) and four CH (450-454 amino acids) families were identified. The variable and constant regions were conserved with their putative domains. All the four constant region domains (CH1-CH2-CH3-CH4) contained each three conserved cysteine residues, which are considered to form the inter- and intra-chain disulfide bridges. There were three carbohydrate acceptor sites in the constant region. In general, the pattern of IgM gene organization seems to resemble that of other teleosts. Moreover, the CH genes in grouper IgM occur as multifamily as reported in Atlantic salmon and common carp. 相似文献