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相似文献
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1.
减蛋综合征病毒33K蛋白基因克隆及结构分析   总被引:2,自引:0,他引:2  
纯化的减蛋综合征病毒(EDSV)DNA经HindⅢ水解、0.8%琼脂糖电泳后,回收各DNA条带并克隆至pBluescriptKS载体,建立了EDSV基因文库,对33K蛋白基因进行了分析。本研究证实,EDSV33K蛋白基因含有2个外显子,与羊腺病毒(OAV)33K蛋白比较,N端编码产物的同源性为30.8%,C端的为60%。用RT-PCR扩增33KmRNA和cDNA克隆及序列分析证实,EDSV33K蛋白含有82碱基(nt)的内含子,去掉内含子33K蛋白基因能形成完整的ORF,其编码产物由177氨基酸(aa)组成,推测分子质量为2.06×104,与人5型腺病毒和OAV的同源性分别为28.1%和44.7%。  相似文献   

2.
鸡减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因的序列分析   总被引:15,自引:2,他引:13  
从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒(EDSV),经非免疫鸭胚增殖后,用差速离心法纯化和蛋白酶K法抽提,获得全长约为34kb的EDSV全基因组。用限制性内切酶HindⅢ酶解EDSV全基因,以pBluescriptⅡ为载体,构建了EDSV的HindⅢ酶解片段的文库,并对其中的D片段(长为3.6kb)进行了序列测定及同源分析,结果提示该片段中唯一一个完整的开放读码框架(ORF)(430~3162位)编码EDSV的六邻体蛋白,其特定氨基酸残基的排列组合和功能区的分布等与其他几个具有代表性的腺病毒的六邻体蛋白相似,它们之间的核苷酸序列同源性在49.6%~72.9%,氨基酸序列同源性在46.3%~83.9%。本研究为进一步阐明EDSV基因组的结构特点,基因结构与功能的关系及进化分类等奠定了基础  相似文献   

3.
从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒(EDSV)AA-2株,经常规方法提取其病毒核酸后,构建了限制性内切酶PstⅠ及HindⅢ水解片段的基因文库。对其中HindⅢ-F片段(52.9~58.9mu)的正反2条链的序列测定发现,其反链存在1个编码容量为387个氨基酸(aa)的开放读码框架(openreadingframe,ORF),经Genebank/EMBL同源搜寻后证实其编码产物为EDSV的DNA结合蛋白(DBP)。与其他腺病毒DBP的氨基酸序列进行同源比较,其N端同源性在19.0%~46.2%之间,C端同源性在27.7%~60.4%之间。腺病毒DBP的3个保守序列CR1,CR2,CR3在EDSVDBP中有较大变化,但EDSVDBP的锌指框架(Zn2+fingermotif)却保留了对其功能必需的残基。  相似文献   

4.
减蛋综合征病毒全基因组DNA文库的构建及物理图谱分析   总被引:1,自引:0,他引:1  
E D S V A A2 株纯化 D N A 经 Hind Ⅲ、 PstⅠ和 Sph Ⅰ水解后, 分别提取 D N A 片段并克隆至p Bluescript K S( + ) 和p G E M3 Zf ( + ) 载体, 构建了 E D S V 全基因文库。根据 E D S V D N A 片段和基因组 D N A 电泳迁移率计算, E D S V 基因组大小为329kb , 通过克隆片段酶谱鉴定, 杂交建立了 E D S V 限制性内切酶 Hind Ⅲ、 Pst Ⅰ和 Sph Ⅰ的物理图谱。  相似文献   

5.
马传染性贫血病毒弱毒株LTR的克隆及序列分析   总被引:9,自引:0,他引:9  
从马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒株感染的驴胎皮肤(FDD)细胞中提取前病毒DNA,以其为模板,通过PCR扩增出EIAV弱毒株的LTR,并将其克隆到载体质粒pUC19中。经酶切分析,PCR及Southern杂交筛选、鉴定,获得含有EIAV弱毒株LTR片段的重组质粒pLTR。对该质粒的序列分析发现,在中国EIAV弱毒株LTR的U3区含有4个与细胞转录因子结合的位点,其中有3个PU.1位点和1个AP-1位点,U3区还存在1个TATATAA启动子序列;R区长为81bp,含有1个帽位点GG和1个Poly(A)信号序列AATAAA;在帽位点下游是1个病毒Tat蛋白结合位点,即TAR位点;U5区长为39bp。中国EIAV弱毒株LTR序列与国外发表的其他毒株序列相比,在LTR的一些调控部位有变异发生,中国EIAV弱毒株与美国EIAV原型株(Wyoming株)LTR区核苷酸序列有18.72%的差异。  相似文献   

6.
传染性法氏囊病病毒VP2/VP0基因在重组鸡痘病毒中的表达   总被引:3,自引:1,他引:2  
以鸡痘病毒复制非必需区TK基因为侧翼,在牛痘病毒A型包涵体晚期启动子(ATI)与16个串联的突变型早期痘苗病毒p7.5启动子组成的复合启动子的下游,分别插入编码传染性法氏囊病病毒(IBDV)结构蛋白VP2和VP2-4-3(VP0)的基因片段后,进行了同源重组和蓝斑筛选,获得2株重组病毒vUTALacVP2-7和vUTALacVP0-10。经ELISA、SDS-PAGE和Westernblot检测表明,重组病毒vUTALacVP2-7能表达VP2,vUTALacVP0-10能表达VP2和VP3,VP2和VP3的Mr分别为41000和32000。  相似文献   

7.
鸡痘病毒282E4株2.2kbTK基因序列分析   总被引:7,自引:2,他引:5  
将鸡痘病毒282E4弱毒株基因组中的3.7kbHindⅢ片段克隆到KS(-)质粒中,亚克隆后,获得含TK基因正反方向插入的2.2kbHindⅢ-ClaI片段的质粒pKFA和pKFB,进而构建出正反方向的系列嵌套缺失质粒。用T7、T3引物所做的核苷酸序列分析表明,2.2kbHindⅢ-ClaI TK基因序列长为2159bp,含有两个完整的读码框架(ORE)X和TK,并确证了TK基因内存在单一酶切点N  相似文献   

8.
根据已报告的传染性法氏囊病病毒( I B D V) c D N A 序列,在病毒 V P2 区域,设计 1 对引物,并在 2 引物上分别加 Pst Ⅰ和 Eco R I酶切位点。对 2 个 I B D V 分离株 J S3 和 J S4,用异硫氰酸胍酚氯仿抽提一步法提取病毒 R N A,然后进行逆转录和 P C R 扩增,将扩增片段经酶切纯化后克隆于 p U C18 质粒载体中,以双脱氧链末端终止法测定 c D N A 序列。将测定的分离株与标准对照株( S1) I B D V V P2 基因片段的核苷酸序列进行计算机分析比较, J S3 与 S1 的同源性为 97% , J S4 与 S1 的同源性为 97% , J S3 与 J S4 的同源性为 99% 。推导编码蛋白氨基酸序列, J S3 和 S1 的同源性为 97% , J S4 与 S1 的同源性为 96% , J S3 和 J S4 的同源性为 98% 。这表明在我国流行的 I B D V 毒株与标准毒株相比不仅在免疫学反应上有差异,而且在病毒核酸序列上有变异,这种变异是造成疫苗免疫失败或免疫逃避的分子基础。  相似文献   

9.
本文应用聚合酶链反应(PCR)技术从构建的新城疫病毒(DNV)cDNA文库中扩增含编码F糖蛋白前体-Fo酶切位点序列的359bp的F蛋白基因cDNA片段。将此359bp cDNA片段经光敏生物素标记后,即成DNV-cDNA探针。该探针能特异性地从感染的尿囊液中检测出DNV强毒株和疫苗毒株的基因组RNA,而不与IBDV-dsRNA,AIBV-ssRNA,EDS76-dsDNA、MDV0dsDNA、F  相似文献   

10.
新城疫病毒(NDV)四平株、昌黎株、青岛株、F48E8株分别接种9日龄SPF鸡胚增殖,蚀斑纯化(3代),生物学特性鉴定及结合基因序列分析,表明NDV四平株、昌黎株、青岛株均为强毒株。经差数、蔗糖密度梯度离心提纯病毒,分别提取RNA,利用一对特异性引物及RT-PCR方法,一次性扩增出 NDV四平株、昌黎株、青岛株和 F48E8株的全长 HN基因,分别将该HN基因克隆入载体pKS(-)并进行测序。序列分析表明,这4个毒株HN基因核苷酸长度均为1713bp,编码571个氨基酸,其中四平株和 F48E8株含有5个糖基化位点,青岛株和昌黎株含有 6个糖基化位点,四平株含有 12个半胱氨酸残基,而昌黎株、青岛株和F48E8株含有13个半胱氨酸残基。3个野生毒株与F48E8相比较,核苷酸序列同源性为85.7%-99.3%,推导的氨基酸序列同源性为 89.5%-98.8%,其中 NDV四平株与标准强毒 F48E8同源关系最近,核苷酸同源性为 99.3%,推导的氨基酸同源性为 98. 8%。  相似文献   

11.
新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的克隆   总被引:2,自引:0,他引:2  
以提纯的我国标准UDVF48E8强毒株基因组RNA为模板、化学合成的融合蛋白(F)基因特异寡核苷酸为引物,反转录合成F基因cDNA,并采用同聚物加尾的方法克隆到细菌质粒pGEM3Zf(-)。经AIX平板筛选和酶切分析,并用F基因片段核酸探针作dot-blot检测,共获得插入片段长度在0.6 ̄2.8kb之间的阳性克隆34个,其中插入片段大于1.5kb的阳性克隆8个。用多种限制性内切酶对阳性克隆pF7  相似文献   

12.
将编码猪水泡病病毒(SVDV)主要抗原蛋白的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pBV220的PrP1串联启动子的下游,分别构建了重组质粒pBV220-VP3(0.6kb)及pBV220-VP3-VP1(约1.6kb),表达的蛋白经Westernblot及Dot-ELISA检测,结果表明,表达的VP3蛋白只与猪水泡病病毒VP3特异性亚单位抗血清反应,而VP3-VP1蛋白未能成功表达。该实验为SVDV疫苗研究奠定了基础。  相似文献   

13.
本研究对猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)的非结构基因,包括ORF1基因、5’端非编码区基因(Non-CodingRigon,NCR)和3’端非编码区基因(NCR)分别进行了分子克隆和测序,并对其基因特征作了研究分析。结果表明,PRRSV-CH-1a株ORF1a起始密码子上游是由保守序列5’UUAACC3’连接的5’NCR,在该区附近的约43个碱基有较高的保守性,其余核苷酸的变异较大。ORF1a编码的多聚蛋白又可切割生成六个非结构蛋白(Nsp1a、Nsp1β、Nsp2-5),其中Nsp2可能具有型特异性,在不同基因型的PRRSV分离株之间表现出较大的变异,和VR2332株的NsP2的编码基因相比有86%的同源性,同LV株只有45%的同源性;ORF1b所编码的聚合蛋白经切割后形成四个非结构蛋白(RdRp、CP2-4),同 ORF1a所编码的蛋白相比较为保守,但是,在CP4的C端仍有较大的变异,其编码区和VR2332株相比有88.7%的同源性,而和LV株只有53.4%的同源性。CH-1a株的ORF1a-ORF1b的衔接区为核糖体移码区,在所有的PRRSV分离株中高度保守,具有保守的5’UUUAAAC3’序列和  相似文献   

14.
减蛋综合征病毒末端片段的克隆及细胞内DNA重组   总被引:6,自引:0,他引:6  
采用9~10日龄非免疫鸭胚增殖的减蛋综合征病毒(EDSV)AA-2毒株,经差速离心法浓缩纯化后,提取病毒基因组DNA。采用碱变性法除去病毒基因组共价结合的末端蛋白(TP)。用限制性内切酶HindⅢ水解纯化的EDSV基因组DNA。经低熔点琼脂糖凝胶电泳后,回收C、D、E片段。克隆到pUC19载体的HindⅢ和SmaⅠ双酶切位点及HindⅢ位点上,经蓝白斑筛选和单、双酶切鉴定,获得了pUHC、pUHD、pUHE重组质粒,其中pUHC含有末端片段。将EDSVSalⅠ水解产生并回收的大片段与pUHC在95℃水浴中变性,65℃复性后,用钙离子介导法,共转染50%~70%的单层鸭胚成纤维细胞,转染后36h开始产生细胞病变(CPE)。48h后将病变细胞反复冻融,经尿囊腔接种9~10日龄鸭胚,回收的尿囊液能凝集鸡红细胞,这种血凝性能被EDSV高免血清抑制,电镜下观察到腺病毒样颗粒。  相似文献   

15.
绿脓杆菌外毒素A受体结合亚单位基因的克隆与表达   总被引:5,自引:2,他引:3  
为防治绿脓杆菌感染造成的细胞坏死及多器官衰竭,本试验克隆了含绿脓杆菌外毒素A(PEA)结合亚单位(Ⅰ区)和部分跨膜亚单位(Ⅱ区)编码309个氨基酸的约1000bp的基因片段,以正确阅读框架将该片段置于原核高效表达T7启动子下游,构建了高效表达质粒pET-EAB。转化宿主菌BL21(DE3)、HMS174(DE3)、HM174(DE3)plysS和BL21(DE3)plysS后,经IPTG诱导4h,均表达了外源目的基因蛋白,其中BL21(DE3)和BL21(DE3)plysS的表达量明显高于其他宿主菌。经SDS-PAGE分析,外源蛋白分子量约34000,与PEAⅠ区和部分Ⅱ区基因所编码的蛋白理论估计值相符,命名为PE34。凝胶薄层扫描显示,PE34含量占菌体蛋白总量的56%。Western-bloting检测证明PE34为所需目的蛋白  相似文献   

16.
鸡痘 病毒282E4株基因组3.6kb BamHI片段序列测定与分析   总被引:1,自引:1,他引:0  
本实验将我国FPV282E4株片段利用DNA测序仪进行了序列测定。经DNASISV3.0分析,该片段A+T含量为60.77%,内含有8个主要的ORFs。用GoldkeyV3.0软件比较了VVP7.5早期4启动子,FPV4b晚期启动子.L2R早/晚期启动子和一个早/晚期启动子与各个ORF上游100bp区域的同源性,没有发现有意义的 同源序列;该片段的核苷酸序列和每个ORF所编码的氨基酸序列在EMBL核酸序列库和  相似文献   

17.
将新城疫病毒(NDV)F46E9株和LaSotaE4株的融合蛋白裂解位点(Fc)基因从本实验室构建的重组质粒pUCF46Fc和pUCLaFc中用EcoRI和SalI切出。将这2个毒株的Fc基因定向克隆入昆杆状病毒表达载体pSXIVVIX3的EcoRI和SalI位点之间,获得2个毒株的Fc基因克隆pX3F46Fc和pX3LaFc。重组质粒用EcoRI/SalI,PstI酶切法,PCR和核酸探针法进行  相似文献   

18.
本文应用聚合酶链反应(PCR)技术从构建的新城疫病毒(NDV)cDNA文库中扩增含编码F糖蛋白前体──Fo酶切位点序列的359bp的F蛋白基因cDNA片段。将此359bpcDNA片段经光敏生物素标记后,即成NDV-cDNA探针。该探针能特异性地从感染的尿囊液中检测出NDV强毒株和疫苗毒株的基因组RNA,而不与IBDv-dsRNA、AIBv-ssRNA、EDS76-dsDNA、MDV-dsDNA,FPV-dsRNA及AILV-dsDNA发生交叉杂交反应。试验结果表明:尽管该探钎含有编码Fo蛋白酶切位点序列的碱基顺序,但它还是不能把NDV的强、弱毒株区分开。这说明NDV强、弱毒株比区域内的碱基存在着相当大的同源性。不过,此探针对NDV来说具有特异性,这就为NDV的诊断技术开创了基因水平检测的新途径。  相似文献   

19.
NDV北京强毒株F48E9经SPF鸡胚增殖 ,超速离心纯化 ,异硫氰酸胍法提取病毒RNA后 ,用RT -PCR扩增 ,得到其融合糖蛋白(F)基因。将扩增产物与pGEM -T载体相连接转化 ,经过Amp -IPTG -Xgal(AIX)平板筛选、HindⅢ酶切及PCR鉴定 ,初步获得了含F基因的阳性克隆。用渐近法对克隆片段进行全序列分析 ,证明得到了全长1744个核苷酸的NDVF蛋白基因。所获得F基因与国外已报道的6个强毒株序列进行比较 ,可知F48E9与其它毒株均有一定差异(氨基酸差异在26/553—44/553) ,但…  相似文献   

20.
新城疫病毒F48E9株F基因主要功能区的核苷酸序列分析   总被引:12,自引:2,他引:10  
本试验首先以NDVF48E9株的基因组RNA为模板,逆转录合成F基因cDNA第一链,再通过PCR技术扩增F基因的cDNA,然后将其克隆到质粒pUC19中,经分子量比较、酶切分析、PCR等方法证明,我们已经获得了NDVF48E9株F基因的阳性克隆。经初步序列分析,FA段核苷酸序列与参考株(D26/76)序列同源性为89%,FB段同源性为91%。二者的氨基酸序列表明,F48E9株F蛋白裂解位点与其它强毒株裂解位点氨基酸组成相同,即112RRQRR116F117。这两段序列中包含的三个Cys残基和三个潜在的糖基化位点都相当保守。  相似文献   

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