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为了克隆和田羊肌肉生长抑制素（Myostatin）蛋白成熟肽编码基因片段,并对其进行原核表达,试验根据绵羊Myostatin蛋白成熟肽基因序列从GenBank（登录号为NM001009428）中设计并合成1对引物。以塔里木大学动物基因工程实验室构建的和田羊Myostatin基因全序列的克隆载体为模板,采用PCR方法特异性扩增和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段;将其克隆到pMD18-T载体中,构建克隆质粒pMD18-T-Ms;经PCR和双酶切分析鉴定,将阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证;测序验证后双酶切pMD18-T-Ms克隆质粒和pET-28a（+）表达质粒,进一步构建pET-28a（+）-Ms重组表达质粒。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导后表达Myostatin蛋白成熟肽,通过SDS-PAGE电泳分析鉴定表达的重组蛋白。结果表明:PCR特异性扩增出1条长度约为330 bp的条带;序列测定分析显示和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段长327 bp,与GenBank上绵羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因从799～1 125 bp片段的核苷酸同源性为100%,所表达的Myostatin蛋白成熟肽分子质量约为14.7 ku。试验成功克隆和田羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因片段,构建了其克隆质粒pMD18-T-Ms和重组表达质粒pET-28a（+）-Ms,并在大肠杆菌中获得有效表达。 相似文献
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根据乳酸乳球菌密码子的偏嗜性,优化设计并合成牛乳铁蛋白肽的两段基因序列LFcinB和LFampin,将其与乳酸乳球菌表达载体pAMJ399分别用SalⅠ和BglⅡ双酶切后进行连接,并电转化至乳酸乳球菌MG1363中,经酶切鉴定表明获得带有两段牛乳铁蛋白肽基因的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363。结果表明,优化表达条件,在GM17培养基中添加3.8%的β-甘油磷酸二钠可以获得表达重组蛋白的适宜pH,West-ern-blot检测可见重组蛋白大小约13 ku,表明牛乳铁蛋白肽在重组乳酸乳球菌中获得了表达。 相似文献
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对鸡沙门氏菌诱导家蝇幼虫构建的抑制性消减文库(SSH)中筛选得到的家蝇双翅肽I(Musca domesticaDiptericin I,MdDptI)基因进行克隆、表达,并对表达产物的抑菌活性进行初步研究。以沙门氏菌诱导家蝇幼虫cDNA为模板,采用cDNA末端快速扩增技术(RACE),对MdDptI基因进行扩增,并对扩增产物进行测序和生物信息学分析,进一步去掉信号肽并构建重组表达质粒pET-28a-MdDptI,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。借助亲和纯化获得目的蛋白,并验证目的蛋白的生物活性。MdDptI基因全长为419 bp,包含一个300 bp的完整开放阅读框(ORF),编码99个氨基酸,其cDNA序列与GenBank中登录号为FJ794602.1的家蝇双翅肽基因同源性为95%。构建了家蝇MdDptI基因的成熟肽原核表达质粒pET-28a-MdDpt-I,并获得成功表达,表达产物约为12 ku,与预期结果一致。纯化后的目的蛋白表现出一定的抑菌活性。本试验获得了MdDptI基因的全长序列,构建了原核表达载体,并成功获得表达纯化。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2015,(5)
本研究通过测定大豆抗原β-Conglycinin酶解肽(52ku)对仔猪空肠上皮细胞(IPEC)通透性及紧密连接蛋白Occludin与ZO-1基因mRNA表达的影响,为探索其对肠道损伤的相关机制提供依据。本试验分别采用不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、2mg·mL-1)52ku酶解肽处理IPEC 2、4、6、8、12、24h后,通过测定细胞存活力(MTT值)、跨上皮细胞电阻值(TEER)以及细胞培养液中碱性磷酸酶(AP)的活性,检测52ku酶解肽对细胞膜通透性的影响。并选取0.5mg·mL-1 52ku酶解肽处理IPEC 24h后,用实时荧光定量PCR方法检测Occludin与ZO-1基因mRNA表达量的变化情况。结果表明,52ku酶解肽处理仔猪空肠上皮细胞后,MTT值和TEER呈时间-剂量依赖性降低(P0.05)。24h处理后,AP活性呈显著升高趋势(P0.05)。与对照组相比,52ku酶解肽可使Occludin和ZO-1基因mRNA相对表达量均呈显著下降趋势(P0.05)。总之,52ku酶解肽使仔猪空肠上皮细胞通透性增加,并降低Occludin或ZO-1的mRNA表达。 相似文献
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《动物营养学报》2021,33(7)
小肽转运载体1(PepT1)在动物肠道小肽的摄取过程中发挥重要作用。本试验旨在研究驴(Equus asinus)PepT1(ePepT1)基因的分子克隆、序列分析和组织表达。提取驴肠道组织总RNA,PCR克隆ePepT1基因片段,测序验证并进行序列分析;采用实时荧光定量PCR(real-time qPCR)方法分别测定驴肾脏、脾脏、心脏、肝脏、肺脏、胃、十二指肠、空肠和回肠组织中ePepT1基因的相对表达量。结果表明:ePepT1开放阅读框为2 124 bp,共编码707个氨基酸残基。蛋白质理化性质预测显示,ePepT1蛋白分子质量为78.6 ku,等电点为7.52,具有11个跨膜区(TMD),且TMD 9和TMD 10之间有1个大的细胞外环;ePepT1蛋白有5个胞外N-糖基化位点,5个胞外蛋白激酶C(PKC)作用位点和3个蛋白激酶A(PKA)作用位点。组织分布研究发现,ePepT1基因在各组织均有表达,但在肠道(十二指肠、空肠和回肠)中相对表达量最高。综上所述,本研究首次克隆了ePepT1基因,研究了其组织表达规律,为进一步研究驴肠道小肽吸收提供了基础。 相似文献
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将O型口蹄疫病毒VP1基因和牛集落刺激因子(GM—CSF)成熟肽基因共同克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，转化RS21后经IPTG诱导，实现了重组融合蛋白BoGM—CSF／VP1在大肠埃希氏菌RS21中的高效表达，表达产物经SDS—PAGE和Western-blotting分析，重组的蛋白质分子质量约为66ku，与预期大小相符。表达蛋白占菌体总蛋白的30％，表达产物以包涵体形式存在；包涵体提取物经变性复性，用透析方法提纯，得到高纯度的表达蛋白。 相似文献
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为了表达一种高效低毒的广谱抑菌蛋白，试验通过T2A连接肽连接蜂毒肽(MEL)与斜带石斑鱼c型溶菌酶(Ec-cLYZ)基因，并克隆至pPICZαA质粒上构建重组表达质粒；将鉴定正确的重组表达质粒用限制性内切酶SacⅠ线性化后电转化至毕赤酵母表达菌株GS115感受态细胞中，构建毕赤酵母表达菌株；利用0.5%甲醇诱导表达，收集上清液进行冻干浓缩并纯化，采用Western-blot法检测重组蛋白的表达情况，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定重组蛋白浓度，试管二倍稀释法分别检测不同浓度重组蛋白对兔红细胞的溶血活性，牛津杯法评价重组蛋白的抑菌效果。结果表明：成功构建出重组表达质粒pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-MEL及毕赤酵母表达菌株GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL、GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ和GS115/pPICZαA-MEL;经甲醇诱导，GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL表达出分子质量为16.5,3.4 ku的重组蛋白，GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ表达出分子质量为16.5 ku的重... 相似文献
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为了探索新型弓形虫疫苗的传递系统,本试验分别构建了细胞渗透肽反式转录激活因子(TAT)与3种弓形虫抗原和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的重组质粒,即pET28a-TAT-EGFP,pET28a-TAT-SAG1,pET28a-TAT-GRA4和pET28a-TAT-AMA1质粒。重组质粒被转化到大肠杆菌中并通过IPTG诱导,成功进行了融合表达,表达产物采用Ni-NTA树脂进行纯化,然后进行SDS-PAGE分析。结果得到31 ku的TAT-EGFP融合蛋白、34 ku的TAT-SAG1融合蛋白、38 ku的TAT-GRA4融合蛋白和62 ku的TAT-AMA1融合蛋白,经过Western blotting分析,感染弓形虫的小鼠血清可特异性地识别融合TAT的SAG1、GRA4蛋白和微弱地识别TAT-AMA1蛋白。 相似文献
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为建立从患有非典型新城疫的蛋鸡组织细胞中提取、纯化热休克蛋白HSP70抗原肽复合物的方法,采取三步蛋白纯化法从非典型新城疫蛋鸡肝脏组织中提取、纯化HSP70抗原肽复合物.经分级硫酸铵盐析后,依次用ConA-Sepharose亲和层析和DEAE-Sephacel离子交换层析分离纯化.所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting进行蛋白分子量及性质鉴定,Bradford法测定蛋白浓度.分离、纯化得到的蛋白经SDS-PAGE、银染鉴定为单一带,分子量为70ku;Western blotting结果证实为HSP70.每克新鲜肝脏细胞最终获得90～110 μg HSP70.使用本分离纯化方法可获得高纯度HSP70抗原肽复合物. 相似文献
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本研究旨在克隆鸡成熟肽c DNA序列并构建原核和真核表达载体,研究其在大肠杆菌和毕赤酵母中诱导后融合蛋白的表达情况。利用PCR技术从pDM19-T-Gal-13质粒中扩增得到成熟肽c DNA序列,将其亚克隆到p GEX-4T-1和p PICZαA质粒中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-Gal-13和真核表达载体pPICZαA-Gal-13,转化大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母X-33,挑取阳性转化子用进行鉴定和诱导表达,(Tricine)SDS-PAGE检测产物的表达情况,以及真核诱导表达上清液对鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。结果显示,成功克隆得到的成熟肽序列长为128bp,包含ATG片段和酶切位点与保护碱共20bp,共编码36个氨基酸;构建获得重组原核表达质粒pGEX-4T-1-Gal-13和真核表达载体pPICZα-A-Gal-13,并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21和酵母X-33,进行诱导表达产物经电泳分析后结果显示,Gal-13融合蛋白在大肠杆菌和酵母中得到大量表达,原核表达分子量是31ku并以包涵体的形式存在,真核表达的分子量5.9 ku并分泌到发酵液中;抑菌试验表明,发现真核表达的发酵无菌上清对鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌活性。 相似文献
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从柔嫩艾美球虫第二代裂殖子总RNA中扩增＆SAG10基因，与pGEM-TEasy载体连接后转化大肠杆菌（E．coli）DH5a，筛选阳性克隆，扩增不舍N端信号肽的编码序列，分别插入表达载体pET-32a（＋）和pMAL-c2X，转化至E．coliRosetta，以IPTG诱导表达。结果表明，pET-32a（＋）-EtSAGIO在E．coliRosetta中的表达产物约占菌体总蛋白的43％，融合蛋白分子质量约为47ku，以包涵体形式存在；而pMAL-c2x-EtSAG10在E．coli Rosetta中表达的重组蛋白为可溶性，表达产物约占菌体总蛋白的35％，融合蛋白分子质量约为69ku。以表达的可溶性EtSAG10重组蛋白100μg／只肌肉注射免疫雏鸡，攻虫后以盲肠病变计分、盲肠卵囊数（OPG）、相对增重率和抗球虫指数（ACI）评价，免疫组相对盲肠卵囊产量为47．7％，抗球虫指数由86．79提高至152．13。提示，重组表达的EtSAG10可诱导雏鸡产生一定的抗球虫免疫保护。 相似文献
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根据猪卵泡抑素(follistatin,FS)基因编码区序列(GenBank登录号:M36512.1)设计并合成1对引物,经PCR扩增获得了FS基因成熟肽序列,将其克隆入pMD18-T载体并转化E.coli DH5α感受态细胞,进行PCR、双酶切及测序验证。然后将其克隆到表达载体pRSET-A的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒pR-FS并转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞,再经PCR、双酶切和测序验证。转化重组质粒pR-FS的重组菌经IPTG诱导后的表达产物进行SDS-PAGE分析,分子质量与预期相符,为26.1 ku左右,经0.2 mmol/L IPTG诱导3 h之后表达量达到最高,约占总菌体蛋白的30%。表达产物可经Ni-NTA凝胶纯化。以上结果表明正确完成了猪FS基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达及纯化。 相似文献
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本研究旨在克隆和表达猪肿瘤坏死因子成熟肽基因及其表达蛋白的生物活性。根据GenBank登录的猪肿瘤坏死因子α(TNF-α)成熟肽基因序列设计一对上下游引物。应用RT-PCR技术直接从丹系长白猪脾脏组织中扩增猪的TNF-α成熟肽基因。将RT-PCR扩增到的特异性片段克隆到pGEM-T Easy载体中,构建pGEM-TNF重组质粒,经宝生物(大连)有限公司测序,该TNF-α成熟肽基因的长度为465 bp,编码154 aa。以重组克隆质粒pGEM-TNF为模板,PCR扩增猪TNF-α成熟肽基因,并将其插入原核表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌(E.coli)BL21中诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明表达的融合蛋白约为38 ku,重组蛋白以包涵体形式表达,表达重组蛋白约占菌体总蛋白的36.8%。细胞毒T细胞试验表明所表达的蛋白经初步纯化、变性复性后,可明显增强淋巴毒性T细胞作用。结果提示长白猪肿瘤坏死因子得到了成功克隆与表达,表达的蛋白产物具有一定的生物活性。 相似文献