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半滑舌鳎vasa调控区的克隆、表达载体构建及其驱动活性检测 总被引：1，自引：1，他引：0
为研究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)vasa(Csvasa)基因调控区的功能,在已克隆的Csvasa基因编码序列的基础上,采用基因组步移和PCR扩增的方法克隆得到Csvasa调控区,通过生物信息学方法分析vasa基因5′区,并构建了含Csvasa基因调控区的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体(p Csvasa-GFP-T),进一步通过显微注射技术初步验证调控区的驱动活性。结果表明,通过基因组步移和PCR扩增获得Csvasa 5′区5 166 bp和3′区1 655 bp,利用在线生物信息学软件对5′区序列进行分析,发现在转录起始点上游26 bp处存在保守的TATA框,以及潜在的转录因子结合点如SRY、Oct-1、Sox-5、CREB、GATA、AP-1、C/EBP、Sp-1、c-Myc、HNF、NKX2-5、V-Myb等。通过显微注射技术,将所构建的p Csvasa-GFP-T表达载体注射于青鳉(Oryzias latipes)受精卵并进行培养观测,发现Csvasa调控区能够驱动GFP在青鳉胚胎内表达,荧光表达率为81%。将有荧光的胚胎培养为成鱼,检测外源基因的整合率为11.5%。这些结果为进一步研究半滑舌鳎原始生殖细胞(PGCs)的标记、追踪和操作研究以及半滑舌鳎的性别控制等奠定了基础。 相似文献
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以青鳉受精卵为试验材料,研究了2种抗冻液EFS40和EFS60对5个不同发育期的胚胎的毒性作用.试验结果表明,青鳉的囊胚期胚胎对EFS40和EFS60的毒性耐受力最差,在EFS40 和EFS60中处理2 min后的成活率分别为41.7%和35.6%,孵化率分别为38.2% 和31.9%,与对照组成活率(96.7%)与孵化率(93.3%)差异极显著(P<0.01);6肌节、16肌节和24肌节胚胎对EFS40 和EFS60的耐受力依次增强;发眼期胚胎的耐受力最强,其胚胎在EFS40中处理30 min后的成活率仍为93.3%,孵化率为77.3%,其余各时期胚胎成活率均显著地降低(P<0.01),发眼期胚胎在EFS60中处理20 min的成活率为75.9%,孵化率70.6%,其余各时期胚胎的成活率都显著地降低(P<0.01).各时期的青鳉胚胎在EFS40和EFS60中都随着毒性处理时间延长其成活率和孵化率逐步降低.EFS60对青鳉胚胎的毒性大于EFS40. 相似文献
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运用同源克隆和RACE方法获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)孕酮受体膜组分1(PGRMC1)的c DNA全长序列,生物信息学分析显示,半滑舌鳎PGRMC1 c DNA序列全长1335 bp,开放阅读框长546 bp;其编码的蛋白是单次跨膜蛋白,在N端13~35位氨基酸残基处有一个跨膜区域。半滑舌鳎PGRMC1氨基酸序列与青鳉(Oryzias latipes)相似性最高,达到了82.9%;与青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)相似度为81.2%。系统进化分析表明,半滑舌鳎PGRMC1与鳉形目和鲀形目鱼类PGRMC1聚为一个分支。采用实时荧光定量RT-PCR技术研究发现,性成熟雌性半滑舌鳎PGRMC1 m RNA在各组织广泛表达,其中在卵巢组织中相对表达量最高(P0.05)。在不同卵巢发育时期,半滑舌鳎PGRMC1 m RNA在脑、垂体和卵巢中的周期表达变化特征显示:脑中PGRMC1 m RNA在卵巢Ⅲ期表达量升高明显,Ⅴ期表达水平最高(P0.05);垂体中PGRMC1 m RNA表达量在卵巢发育Ⅴ期达峰值(P0.05);在卵巢中,PGRMC1 m RNA表达水平从卵巢发育Ⅱ到Ⅴ期稳步上升,Ⅴ期时达到最高值(P0.05)。综上,半滑舌鳎PGRMC1基因主要参与卵巢的发育和成熟过程,并在繁殖期介导孕酮调控卵母细胞的最终成熟,研究结果为半滑舌鳎繁殖内分泌调控研究提供了基础资料。 相似文献
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温度、盐度、光照对半滑舌鳎胚胎发育的影响及孵化条件调控技术研究 总被引：26，自引：12，他引：14
对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Giinther)胚胎发育与盐度、温度和光照的关系作了初步探讨,并提出胚胎孵化的优化技术以促进半滑舌鳎人工繁育工作的发展。实验表明,受精卵孵化的适宜盐度为25～35,此盐度范围内孵化率都可达88％以上,盐度低于20或高于40孵化率会明显降低,同时初孵仔鱼畸形率会随之升高。胚胎在22～24℃范围内的孵化率最高,达82％以上,且畸形率最低。不同的光照节律和光照强度对胚胎的孵化率和初孵仔鱼畸形率影响不大,但是对胚胎发育速率和孵化时间具有明显的延滞或促进作用。综合胚胎发育与环境因子的关系,结合实际操作技术,对半滑舌鳎受精卵孵化条件加以优化,提出了工厂化育苗条件下提高半滑舌鳎受精卵孵化率、获得优质仔鱼的孵化方法和技术工艺。 相似文献
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采用组织学和分子生物学方法,研究了投喂芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)后暗纹东方鲀(Takifugu obscures)初孵仔鱼CYP19A、DMRT1基因表达以及性腺的组织学变化,以期进一步了解P450芳香化酶(P450arom)在鱼类早期性别分化过程中的作用。RT-PCR结果显示,对照组样品CYP19A和DMRT1表达显示性二态,雌性表达CYP19A基因,雄性表达DMRT1基因。LE处理组在性别分化期间,雄性样品单一表达DMRT1,雌性样品则同时表达CYP19A和DMRT1。qRT-PCR结果显示:LE处理组雌性仔鱼CYP19A基因表达被显著抑;虽然在仔鱼出膜后22d(dph)的表达水平高于9 dph,但仅为同日对照组的2.11%。LE处理组雌性样品22 dph时DMRT1基因表达量上调,至150 dph时达对照组雄性水平。55 dph的性腺组织学结果表明,LE处理可导致暗纹东方鲀稚鱼原始卵巢退化,并向功能性精巢发育。150 dph的LE处理组性腺均为精巢,并与对照组精巢发育同步。结论认为,暗纹东方鲀性腺分化期间P450arom是卵巢形成和维持发育所必须的,抑制P450arom活性可导致雌性暗纹东方鲀发生雄性化逆转。 相似文献
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紫外灭活的异源和同源精子诱导的半滑舌鳎单倍体胚胎发育过程比较 总被引：2，自引：0，他引：2
为探讨在雌核发育研究中紫外灭活的异源精子的细胞质等是否对“受精”卵的发育产生影响,本文对紫外灭活的异源和同源精子诱导的半滑舌鳎单倍体胚胎发育过程进行了比较研究。结果显示,在胚盘形成期、二细胞期、多细胞期和囊胚期,异源和同源精子诱导的半滑舌鳎单倍体胚胎发育时序及形态无显著差异。之后,灭活的异源精子诱导的单倍体胚胎发育速度比同源精子诱导的单倍体胚胎要慢,至受精后18h 48min已慢1个发育时期,说明在发育前期,异源精子诱导的单倍体胚胎发育阻力更大。肌节期后,同源精子诱导的半滑舌鳎单倍体胚胎发育也严重受阻,与异源精子诱导的单倍体胚胎发育速度无显著差异;且单倍体胚胎陆续大量死亡,但异源精子诱导的单倍体胚胎死亡率明显要大于同源精子诱导的单倍体胚胎。异源和同源精子诱导的单倍体胚胎孵出的仔鱼均表现有单倍体综合症,外形基本一致。为确保紫外线处理将精子完全灭活,当紫外灭活的异源和同源精子诱导的半滑舌鳎单倍体胚胎发育至原肠后期时,各取30粒用倍性分析仪检测其倍性,结果显示全为单倍体。 相似文献
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以培育大菱鲆Scophthalmus maximus耐高温品系为目的,研究了胚胎和仔稚鱼对热刺激的耐受力差别,为通过高温刺激选育大菱鲆耐高温品系提供指导和基础数据。实验分别对大菱鲆胚胎期(孵化前期)、卵黄囊期(初孵仔鱼,0dph)、前弯曲期(10dph)和弯曲期(25dph)的仔鱼、稚鱼(50dph)使用22～33℃范围内不同梯度的高温海水,进行突变热刺激,2h后转入原水体中培育,记录之后60～84h的死亡率、仔鱼孵化率、畸形率等数据。结果表明,上述5个发育期大菱鲆经受2h热刺激的亚致死温度为24、23、<22、28、28℃,半致死温度为26、28、22、29、29℃,致死温度为30、29、27、30、30℃。根据热刺激后24和48h死亡率,耐热能力由弱到强依次为10dph<胚胎<0dph<25dph<50dph,总体上呈现随生长发育逐渐增强的趋势。10dph左右可能为大菱鲆热刺激耐受力低谷,此时也是开鳔期,对外界环境反应灵敏,受到不良环境刺激易导致死亡。 相似文献
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大口黑鲈hepcidin真核表达载体构建及表达的初步研究 总被引：1，自引：0，他引：1
将大口黑鲈(Micropterus salmoides)抗菌肽hepcidin cDNA定向插入真核表达载体pPICZαA,通过SacI酶切线性化重组表达质粒pPICZαA-hepcidin,电转化毕赤酵母P.pastoris GS115,PCR扩增筛选,甲醇诱导表达等进行了hepcidin真核表达工程菌株的构建及诱导表达。结果显示:hepcidin cDNA成功插入表达载体pPICZαA,并整合到酵母基因组中;经甲醇诱导,RT-PCR检测显示hepcidin cDNA在酵母细胞中成功转录。 相似文献
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牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在全球范围内导致牡蛎、扇贝与蚶类的大规模死亡,成为双壳贝类养殖产业的重要威胁。为了解OsHV-1的结构与致病机制。本研究利用HEK293t细胞,构建OsHV-1主要核衣壳蛋白（ORF104和ORF33）的真核表达系统,并对ORF104和ORF33潜在相互作用进行检测。实验首先通过特异性PCR扩增技术得到orf 104和orf 33的基因序列,根据其编码蛋白的理化性质、跨膜区与三维结构等生物信息学分析结果,选择pCDNA3.1构建两种基因的重组表达质粒。重组质粒经大肠杆菌扩增、提取后,利用转染试剂Lipo8000?将pCDNA3.1-orf 104与pCDNA3.1-orf 33分别单独或共转染至人胚肾细胞(HEK293t)。然后,将转染后的细胞培养18 h后裂解收集蛋白。最后利用蛋白免疫印迹检测(Western Blot,WB)与负染电镜检测两种目的蛋白的表达情况。结果显示,实验成功构建了OsHV-1衣壳蛋白ORF104和ORF33的重组表达质粒载体,通过真核细胞表达得到大小约为135与35 ku的目的蛋白。研究表明,表达质粒可在真核表达系统中实现蛋白单独转染与共转染,共转染蛋白间可能存在相互作用的趋势并形成多聚体,其中,ORF33自身即可形成分子量不同的多聚体。本研究首次利用真核表达系统开展OsHV-1关键结构蛋白的表达,为进一步开展该病毒结构蛋白功能与互作,以及病毒入侵机制研究奠定基础。 相似文献
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卤代烷烃脱卤酶(HLD)是一类能降解卤代脂肪化合物的酶,为今后将藻类HLD用于环境中卤素化合物的降解提供资料,本实验利用生物信息学、荧光定量PCR和pET28a表达系统对大型红藻龙须菜中HLD的酶学特性、转录表达和原核表达进行了研究。生物信息学分析结果显示,龙须菜中HLD基因(记为GlHLD)开放阅读框长969 bp,理论分子量约为36.33 ku,等电点约为5.53;该Gl HLD序列与绳状龙须菜的一条HLD序列(PXF45553.1)完全一致,与绳状龙须菜和皱波角叉菜等红藻优先聚类。荧光定量PCR结果表明,高温下底物1,2-二氯乙烷和植物激素水杨酸可促进GlHLD基因的表达,其表达量分别为常温组的3.64、2.64和2.43倍。GlHLD与pET28a质粒构建的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出具有脱卤酶活性的蛋白;该蛋白的最佳诱导条件为16°C、0.1 mmol/L IPTG诱导12 h,最后用镍柱对GlHLD蛋白进行了初步纯化。本研究为进一步了解藻类HLD家族及获得高纯度HLD酶奠定了基础。 相似文献
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本研究基于转录组学的分析结果,克隆分析了银鲳(Pampus argenteus)二肽酶(dehydropeptidase, dp1)、羧肽酶A (carboxypeptidases, cpa2l)和磺基转移酶(sulfotransferase, sult2) 3个营养代谢相关基因,并探讨了其在消化吸收水母(Scyphozoa)过程中发挥的功能。通过RACE技术克隆获得了银鲳dp1、cpa2l和sult2基因的cDNA全长序列。dp1基因全长2 522 bp,包含1个1 272 bp的开放阅读框(ORF),含有1个由23个氨基酸组成的信号蛋白肽和1个典型的酰胺水解酶超家族的结构域。cpa2l基因全长1 421 bp,ORF长1 260 bp,含有1个由16个氨基酸组成的信号蛋白肽和1个典型的M14金属羧肽酶家族的结构域。sult2基因全长1 834 bp,ORF长714 bp,含有1个典型的磺基转移酶家族的结构域。银鲳Dp1、Cpa2l和Sult2与蓝鳍金枪鱼(Thunnus maccoyii)同源性最高,系统进化树结果也显示,银鲳dp1、cpa2l和sult2与蓝鳍金枪鱼对应基因聚在一个分支上,亲缘关系最近。运用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测了dp1、cpa2l和sult2基因在不同组织中的表达水平及摄食水母对3个基因不同组织中表达规律的影响。结果显示,银鲳dp1基因在肝脏中表达量最高(P<0.05),与未摄食水母组相比,dp1基因在摄食水母组的脑和鳃中表达量均极显著增加(P<0.01),在中肠和肾脏中显著增加(P<0.05),而在肌肉中显著下降(P<0.05)。cpa2l基因在未摄食水母组的中肠中表达量最高,而在摄食水母组的肾脏中表达量最高(P<0.05),与未摄食水母组相比,摄食水母组cpa2l基因在肝脏中的表达量极显著增加(P<0.01),而在中肠和肌肉中却极显著下降(P<0.01)。sult2基因在肝脏中表达量最高(P<0.05),与未摄食水母组相比,sult2基因在摄食水母组的中肠、脑、鳃、肝脏和肾脏中表达量显著增加(P<0.05)。研究表明,dp1、cpa2l和sult2基因在银鲳摄食水母后机体营养物质的消化吸收和代谢过程中起重要的调节作用,基于摄食水母后3个基因组织表达模式的比较分析,推测dp1主要参与调控消化吸收和组织中营养素沉积的过程,cpa2l主要参与调控肝脏中营养代谢的过程,而sult2可能在整个消化吸收和代谢过程中均起到重要的调控作用。 相似文献
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LrrG和表面免疫原性蛋白（Sip）是无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的2种表面蛋白,具有良好的免疫原性。为获得罗非鱼无乳链球菌表面蛋白LrrG和Sip蛋白的融合蛋白,该试验采用基因拼接技术中的双酶切法分2步逐个将Sip和LrrG基因插入pColdⅡ载体中,构建原核表达载体pColdⅡ-LrrG-Sip。将成功构建的融合基因原核表达载体转化感受态细胞BL21（DE3）,进行诱导表达条件的优化。结果显示,15℃、IPTG 0.5 mmol·L-1诱导9 h,目的蛋白呈可溶状态的表达量最高。Western Blot检测结果显示LrrG-Sip融合蛋白大小与预测一致（162kDa）,说明成功构建了融合基因,为罗非鱼源无乳链球菌亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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蟹类原肌球蛋白基因的克隆与表达 总被引：4，自引：0，他引：4
原肌球蛋白是甲壳类动物的主要过敏原之一。本文通过分子生物学技术方法,分别克隆得到锯缘青蟹(Scylla serrata)、中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的原肌球蛋白基因序列。测序结果表明,三个基因的序列长度均为855 bp,编码284个氨基酸残基,三者氨基酸序列同源性为99.3%。三种蟹的原肌球蛋白基因序列与GenBank中其他甲壳类动物的原肌球蛋白具有很高的同源性。将锯缘青蟹的原肌球蛋白基因与pGEX-4T-3载体连接后,经IPTG诱导得到分子量约为61 kDa的融合表达蛋白。通过与甲壳类过敏患者血清的免疫印迹反应,证实融合表达的原肌球蛋白具有过敏原性,表明原肌球蛋白是蟹类的主要过敏原之一。该融合蛋白有望用于甲壳类食物过敏诊断试剂的开发与应用。 相似文献
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